La glie corticale chez les souris SOD1 (G93A) est subtilement affectée par la SLA

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6538 (2023) Citer cet article

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Le rôle de la glie dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) est indéniable. Leur activité liée à la maladie a été largement étudiée dans la moelle épinière, mais seulement en partie dans le cerveau. Nous présentons ici une étude complète de la glie dans le cortex de souris SOD1(G93A) - un modèle largement utilisé de la SLA. En utilisant le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) et l'immunohistochimie, nous avons inspecté les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes, à quatre stades de la maladie, en respectant le facteur sexe. Nous rapportons des changements minimes de la glie tout au long de la progression de la maladie et quel que soit le sexe. Des analyses pseudo-en masse et unicellulaires ont révélé de subtiles altérations transcriptionnelles liées à la maladie au stade terminal dans la microglie et les oligodendrocytes, qui ont été soutenues par l'immunohistochimie. Par conséquent, nos données appuient l'hypothèse selon laquelle le cortex de souris SOD1 (G93A) ne récapitule pas la maladie chez les patients, et nous recommandons l'utilisation d'un modèle différent pour les études futures de la pathologie corticale de la SLA.

La dégénérescence caractéristique des motoneurones (MN) dans la SLA provoque initialement une atrophie musculaire progressive entraînant des difficultés de mouvement, d'élocution et de déglutition, et une insuffisance respiratoire au stade final. Généralement, la SLA est considérée comme une maladie multifactorielle aux mécanismes pathologiques mal compris, et avec une survie médiane de trois à cinq ans. Il n'existe actuellement aucun remède ou prévention disponible, seulement un traitement symptomatique.

Bien que les MN soient reconnus comme le principal type de cellule affecté par la pathologie, de nombreuses études ont confirmé que les cellules non neuronales, y compris la glie, subissent des modifications et participent à la progression de la SLA1,2. Les cellules gliales répondent à la neurodégénérescence ou aux blessures par divers mécanismes. La microglie et les astrocytes acquièrent un état dit réactif marqué par des changements d'expression génique et de morphologie. En activant les voies inflammatoires et anti-inflammatoires, ils protègent les tissus contre d'autres dommages. Cependant, au stade chronique des maladies, ils ont un effet nocif et contribuent à la progression de la neurodégénérescence. Traditionnellement, les astrocytes réactifs et la microglie étaient divisés en sous-types A1 et A2 ou M1 et M2, respectivement. Cependant, cette terminologie est actuellement considérée comme obsolète, car de nombreuses sous-populations de cellules gliales avec des signatures génétiques spécifiques ont récemment été décrites dans différents modèles de maladies3,4,5. Les astrocytes associés à la maladie (DAA), la microglie associée à la maladie (DAM), la microglie à réponse activée (ARM) et la microglie à réponse à l'interféron (IRM) n'en sont que quelques exemples. Les oligodendrocytes, en revanche, sont plus sensibles aux changements pathologiques. En réaction à la maladie, ils ont tendance à dégénérer plutôt qu'à se transformer en un état réactif. Cependant, leur rôle passif dans la progression de la maladie a récemment été remis en question par des études décrivant leur contribution à l'immunoprotection, à la signalisation de l'interféron et au traitement et à la présentation de l'antigène6,7.

Le rôle des astrocytes, de la microglie et des oligodendrocytes, ainsi que leurs modifications respectives liées à la pathologie, ont été signalés à plusieurs reprises chez des patients atteints de SLA8,9,10. La majorité des données disponibles proviennent de la moelle épinière, mais quelques études ont également rapporté une pathologie gliale dans le cortex11. Les changements pathologiques connus ont été principalement identifiés dans les tissus post mortem, ce qui ne permet pas d'étudier les mécanismes de la maladie, ce qui augmente le besoin d'un modèle animal fiable. Actuellement, la souris SOD1(G93A) représente le modèle le plus largement utilisé ressemblant à l'ALS12 familiale. Phénotypiquement, le modèle correspond à l'évolution de la maladie, et des études sur la moelle épinière et le tronc cérébral ont rapporté des changements cellulaires liés à la SLA précédemment observés chez des patients2,8,13,14,15,16. Le cortex, cependant, semble être un sujet de controverse. Le nombre d'études est limité et les résultats suggèrent des résultats contradictoires. Alors que certains montrent que les cellules gliales corticales et les MN sont affectées par le phénotype de type ALS17,18,19,20, d'autres ne rapportent aucun effet dans la zone corticale dans le modèle SOD1(G93A)21.

Dans cette étude, nous avons cherché à fournir un aperçu complet de la pathologie gliale SOD1 dans le cortex de la souris SOD1(G93A). En combinant des méthodes robustes et à haut débit telles que le scRNA-seq et l'immunohistochimie, nous avons analysé les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes, tout au long de l'évolution de la maladie, caractérisée par des tests comportementaux. Le scRNA-seq a été utilisé pour surveiller les changements transcriptionnels dans les cellules gliales individuelles dans le temps et pour étudier la composition de populations gliales distinctes avec un accent particulier sur les sous-populations associées à la maladie. Pour compléter la caractérisation de la pathologie corticale, nous avons évalué les changements morphologiques et quantitatifs des cellules gliales par immunohistochimie, en mesurant les marqueurs protéiques canoniques.

Pour toutes les expériences, nous avons utilisé des souris transgéniques exprimant des niveaux élevés de SOD1(G93A) humaine (souche JAX : 004435 C57BL/6 J-Tg (SOD1*G93A)1Gur/J) et leurs compagnons de litière non porteurs12. Cette souche contient ~ 25 copies du transgène et sa survie à 50 % varie de 157 ± 9,3 jours (https://www.jax.org/strain/004435). Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de la République tchèque (numéro d'approbation 40/2019). Toutes les méthodes utilisant des animaux ont été réalisées conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes (86/609/CEE). Tous les animaux utilisés pour les expériences ont été sacrifiés en utilisant du pentobarbital suivi d'une décapitation. En raison d'un stade avancé de la maladie, les souris mutantes ont été euthanasiées à l'aide de dioxyde de carbone peu après avoir atteint l'âge de cinq mois. Tous les efforts ont été faits pour minimiser à la fois la souffrance et le nombre d'animaux utilisés. L'étude est rapportée conformément aux directives ARRIVE.

Nous avons effectué le test de suspension de grille métallique et le test de tige rotative (Mouse RotaRod NG 47650, Ugo Basile, Italie) pour évaluer la force musculaire, la fonction et la coordination tout au long de la maladie. Le poids a également été mesuré en tant que paramètre supplémentaire de la progression des symptômes. Les tests consistaient en une seule session de trois tentatives chaque semaine, commençant à P30, et duraient 14 semaines. Avant l'expérience, tous les animaux ont effectué un entraînement. Les données sont présentées sous forme de moyenne ou moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) pour n animaux. Une ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées avec la correction de comparaison multiple de Holm-Sidak a été utilisée pour analyser les différences entre les groupes.

La souris a été placée sur un couvercle métallique sur mesure, à environ 60 cm au-dessus d'un fond recouvert de copeaux de bois, et retournée. La latence à la chute a été mesurée. Au début d'une période de test, nous avons formé chaque souris trois fois consécutives pendant au moins 180 s. Lors de la session expérimentale, la souris a fait trois tentatives pour s'accrocher au couvercle. Nous avons noté le meilleur score sur les trois avec un maximum de 180 s.

La souris a été placée sur une tige fixe face à contre-sens de la rotation. La tige a commencé à tourner à une vitesse constante de 15 tr/min et la latence à la chute a été mesurée. Chaque souris a été entraînée trois fois consécutives d'au moins 180 s à des vitesses de 5, 10 et 15 tr/min. Dans la session expérimentale, la souris a eu trois tentatives pour rester sur la tige. Nous avons noté le meilleur score sur les trois avec un maximum de 180 s.

Pour les analyses immunohistochimiques, les animaux ont été profondément anesthésiés avec du PTB (100 mg/kg, ip), perfusés par voie transcardiaque avec 20 ml de solution saline suivis de 20 ml de paraformaldéhyde refroidi à 4 % (PFA) dans un tampon phosphate 0,1 M et décapités. Les cerveaux et les moelles épinières ont été disséqués, post-fixés pendant une nuit avec du PFA et traités avec un gradient de saccharose (allant de 10 à 30 %) pour la cryoprotection. Des tranches coronales de 30 μm d'épaisseur ont été préparées à l'aide d'un cryostat (Leica CM1850, Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne).

Pour la coloration immunohistochimique, les tranches ont été lavées dans une solution saline tampon phosphate suivie d'un blocage des sites de liaison non spécifiques avec 5 % de chimiobloquant (Millipore, Billerica, MA) et 0,2 % de Triton dans une solution saline tampon phosphate. La solution de blocage a également été utilisée comme diluant pour les antisérums. Les tranches ont été incubées avec les anticorps primaires pendant une nuit et les anticorps secondaires ont été appliqués pendant 2 h à 4–8 °C.

Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : famille anti-aldéhyde déshydrogénase 1 de lapin, membre L1 (ALDH1L1 1:500 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), protéine basique anti-myéline de rat (MBP, 1:500, Biorad, Hercules, CA, États-Unis ), acétyltransférase anti-choline de lapin (ChAT, 1:200, Merck, Darmstadt, Allemagne), molécule adaptatrice de liaison au calcium anti-ionisée de lapin 1 (Iba-1, 1:500, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), caspase clivée de lapin -3 (CC3, 1:50, CellSignaling, Massachusetts, USA) et polypose adénomateuse coli (APC, 1:200, Merck, Darmstadt, Allemagne). Les anticorps secondaires étaient des IgG anti-lapin de chèvre ou des IgG anti-souris de chèvre conjugués à Alexa Fluor 488, et des IgG anti-rat de poulet conjugués à Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen, Waltham, MA, US). Les noyaux cellulaires ont été visualisés par coloration DAPI (Merck, Darmstadt, Allemagne). Un microscope confocal Zeiss LSM 880 Airyscan équipé de lasers Ar/HeNe et d'objectifs à eau × 40 ou à huile × 63 a été utilisé pour l'analyse immunohistochimique.

Toutes les analyses ont été effectuées à l'aide du logiciel de traitement d'images FIJI (ImageJ 2.9.0/1.53t)22. Des images confocales (212 × 212 × 30 μm) ont été prises à partir de tranches coronales cérébrales (1 mm et 2 mm du bregma), couvrant la zone du cortex moteur primaire et secondaire et du cortex somatosensoriel primaire (cinq à six zones par hémisphère).

Pour quantifier l'intensité de fluorescence ALDH1L1, nous avons utilisé six animaux pour chaque groupe et deux tranches de chaque animal. La méthode de seuillage (méthode Yen) a été utilisée pour filtrer le bruit de fond. Nous avons calculé la densité moyenne intégrée limitée au seuil pour chaque animal.

Pour quantifier les changements de morphologie de la microglie, nous avons effectué une analyse Sholl sur des cellules positives pour IBA1 à l'aide du plugin d'analyse Sholl23. Nous avons utilisé six animaux pour le groupe et deux tranches de cerveau de chaque animal. Pour chaque tranche de cerveau, un minimum de huit cellules a été analysé. Pour l'analyse Sholl, les images consécutives de la pile z ont été converties en projection d'intensité maximale et la projection a été seuillée pour créer un masque binaire. Nous avons compté le nombre d'intersections à partir de 5 μm du centre du soma, avec un pas de rayon de 5 μm.

Pour quantifier les cellules APC et CC3-positives, trois animaux de chaque groupe et une tranche (1 mm de bregma) de chaque animal ont été utilisés pour l'analyse. Le nombre de cellules APC ou CC3 positives a été déterminé à partir d'images superposées et exprimé en pourcentage de cellules exprimant un marqueur par rapport au nombre total de cellules DAPI +. Le pourcentage de cellules apoptotiques a ensuite été exprimé sous la forme d'un rapport de CC3+ aux cellules APC+ précédemment comptées.

Un microscope confocal Olympus FV10i équipé d'un objectif à huile × 60 a été utilisé pour l'analyse de la coloration MBP. Nous avons utilisé six animaux pour chaque groupe et deux tranches pour chaque animal et scanné 12 zones par hémisphère. La densité d'expression de MBP a été déterminée à l'aide d'une macro FIJI (ImageJ) personnalisée (disponible sur : https://github.com/jakubzahumensky/JT_paper). En bref, pour maintenir la dimensionnalité des images analysées égale, la macro a extrait une sous-pile des 20 images les plus lumineuses de chaque z-stack. Cela a été suivi par la création d'un masque binaire des fibres dans chaque trame et la mesure de la fraction de trame couverte par le masque. Au sein de chaque sous-empilement, la moyenne de cette valeur a été calculée, donnant la fraction volumique occupée par les fibres. L'analyse statistique des différences entre les groupes a été réalisée à l'aide d'un test t non apparié. Toutes les barres d'erreur dans les graphiques représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM).

Les souris ont été profondément anesthésiées avec du pentobarbital (PTB) (100 mg/kg, ip) et perfusées par voie transcardiaque avec un tampon d'isolement froid (4–8 °C) contenant (en mM) : NaCl 136,0, KCl 5,4, HEPES 10,0, glucose 5,5, osmolalité 290 ± 3 mOsmol/kg. Nous avons isolé le cortex somatosensoriel moteur et primaire et suivi le protocole de dissociation du cerveau adulte pour les souris et les rats (Milteyni-Biotec, Allemagne), mais nous avons omis l'étape d'élimination des globules rouges. Pour empêcher l'activation des gènes précoces immédiats (IEG), nous avons utilisé l'actinomycine D, un inhibiteur de la transcription (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO), 30 μM lors de la dissociation enzymatique et 3 μM dans les étapes suivantes24. Après l'élimination des débris, les cellules ont été superposées sur 5 ml de solution d'inhibiteur d'ovomucoïde (Worthington, NJ) et récoltées par centrifugation (300 × g pendant 6 min). Les agrégats cellulaires potentiels ont été éliminés par des tamis cellulaires de 70 μm (Becton Dickinson, NJ). Nous avons marqué la suspension finale avec des anticorps ACSA-2, Cd11b et O4 conjugués respectivement à l'allophycocyanine et à la phycoérythrine (4 ° C, 10 min; Miltenyi-Biotec, Allemagne) pour permettre l'enrichissement des astrocytes25, de la microglie et des oligodendrocytes. Les cellules ont été enrichies par cytométrie en flux (FACS ; BD Influx), calibrées pour trier les cellules ACSA-2+, Cd11b+ et O4+. Hoechst 33258 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a été utilisé pour vérifier la viabilité. Les cellules ont été recueillies dans 200 ul de milieu d'Eagle modifié d'Advanced Dulbecco, additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (ThermoFisher Scientific Waltham, MA). Quatre animaux par condition ont été regroupés pour la préparation de la suspension cellulaire. Après FACS, la suspension cellulaire a été centrifugée, concentrée et utilisée pour la préparation de la bibliothèque.

Les kits de réactifs Chromium Next GEM Single Cell 3' v3.1 (10 × Genomics, Pleasanton, CA) ont été utilisés pour préparer les bibliothèques de séquençage, et le protocole a été réalisé conformément aux instructions du fabricant. En bref, la plate-forme 10 × Chromium a été utilisée pour encapsuler des cellules individuelles dans des gouttelettes avec des billes recouvertes de codes à barres 10 × spécifiques aux cellules, d'identificateurs moléculaires uniques (UMI) et de séquences poly (dT). Après transcription inverse, les bibliothèques d'ADNc ont été amplifiées (13 à 14 cycles), fragmentées et ligaturées à des adaptateurs de séquençage. Des billes magnétiques SPRISelect ont été utilisées pour la purification de la suspension d'ADNc et la sélection de la taille des fragments. La concentration et la qualité des bibliothèques ont été mesurées à l'aide du kit de dosage Qubit dsDNA HS (Invitrogen) et du kit de fragments NGS Fragment Analyzer HS (#DNF-474, Agilent). Les bibliothèques ont été regroupées et séquencées en mode apparié à l'aide du kit de réactifs Illumina NovaSeq 6000 SP, la lecture 1 contenant un code-barres et un UMI, et la lecture 2 couvrant la séquence d'intérêt. Données de séquençage composées d'env. 100 à 200 millions de lectures par échantillon (Supp. Tab. 4).

Les données de séquençage ont été alignées sur le génome de souris de référence GRCm38 et annotées (annotation GENCODE version M8) par STARsolo (STAR ​​version 2.7.3a)26. La fonction EmptyDrops (package DropletUtils R)27 avec un seuil de 100 UMI et FDR < = 0,001 a été appliquée pour ne conserver que les gouttelettes contenant des cellules. Les cellules ont été comptées sur la base des codes-barres spécifiques à chaque gouttelette/cellule. Le nombre final de cellules détectées différait d'un échantillon à l'autre et se situait dans la plage d'env. de 2500 à 6800 cellules (Supp. Tab. 4).

Les données ont ensuite été traitées à l'aide du package Seurat R (version 4.1.1)28. Tout d'abord, les données de tous les échantillons ont été transformées en SC et intégrées (à l'exclusion des gènes mitochondriaux et ribosomiques, préfixés par mt- ou Rps/Rpl, respectivement). Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) a été utilisé pour visualiser 17 composants principaux (PC), qui ont ensuite été regroupés (fonctions FindNeighbors et FindClusters, résolution UMAP 0,5). Les clusters ont été annotés en fonction de l'expression de gènes marqueurs connus des populations cellulaires attendues et de leur correspondance avec les marqueurs trouvés par la fonction FindAllMarkers (au moins 80 % de cellules dans le cluster exprimant les marqueurs). Le package DoubletFinder29 R a été utilisé pour l'identification des gouttelettes contenant potentiellement plus d'une cellule. Le taux de formation de doublets a été fixé à 3,9 %, tel qu'estimé par 10 × Genomics, et les données ont été traitées conformément aux recommandations des auteurs. Les clusters exprimant des marqueurs ambigus et contenant un nombre plus élevé de doublets ont été filtrés de l'ensemble de données.

Le sexe (masculin, féminin) a été attribué aux cellules individuelles en fonction de l'expression des gènes codés par les chromosomes X (Xist) et Y, et ceux ne correspondant pas à nos critères (mâle : nombre de Xist < 1, nFeature_Y > 0 ; femme : nombre de Xist > 0, nFeature_Y < 2, nCount_Y < 2 ; nFeature_Y étant un certain nombre de gènes codés en Y et nCount_Y étant un nombre de transcrits cartographiés sur le chromosome Y) ont été exclus de l'ensemble de données (Supp. Fig. 1a). Ces cellules classées comme «indéfinies» représentaient près du tiers du nombre total de cellules et représentaient des cellules de faible qualité (Supp. Fig. 1b).

Un profil d'expression génique spécifique a également été utilisé pour déterminer une phase du cycle cellulaire de chaque cellule (fonction CellCycleScoring Seurat) afin de s'assurer que les cellules dans toutes les phases sont également réparties entre les clusters. Les types de cellules individuels ont été filtrés en fonction du nombre de gènes détectés (nFeature_RNA), du nombre de comptages (nCount_RNA) et de la quantité d'ARN mitochondrial (percent.mt). Les seuils spécifiques à chaque type de cellule d'intérêt étaient les suivants : astrocytes—nFeature_RNA > 1 000, 2 000 < nCount_RNA < 10 000, percent.mt < 8 ; microglie—nFeature_RNA > 700, 1000 < nCount_RNA < 10 000, percent.mt < 5 ; oligodendrocytes—nFeature_RNA > 1300, 2500 < nCount_RNA < 50 000, percent.mt < 5 (Supp. Fig. 1d). La dissociation tissulaire peut induire l'expression des IEG, la première réponse cellulaire rapide aux stimuli24,30. Un ensemble d'IEG (par exemple, les facteurs de transcription Fos et Jun) a été projeté sur l'UMAP à l'aide de la fonction AddModuleScore pour étudier le niveau d'induction de ces gènes par la préparation d'échantillons (Supp. Fig. 1c). Le package SoupX R (version 1.5.2)31 a été appliqué pour supprimer le fond d'ARN contaminant. Les données non filtrées et annotées ont été fournies en entrée. La fraction de contamination a été estimée par la méthode automatisée et se situait entre 1 et 2 % pour les échantillons individuels. Les valeurs de comptage ont ensuite été corrigées de la contamination.

Pour afficher les différences globales entre les échantillons par analyse en composantes principales pseudobulk (PCA), l'ensemble de données normalisé et mis à l'échelle a été utilisé pour créer des données pseudobulk en additionnant le nombre de gènes de cellules appartenant au même état, âge et sexe.

Les gènes différentiellement exprimés (DEG) dans l'ensemble de données unicellulaire ont été identifiés par le test t dans la fonction FindMarkers de Seurat. Des données normalisées et mises à l'échelle dans le test d'ARN ont été utilisées dans cette analyse. Le seuil de valeur ajustée en P (padj) a été fixé à 0, 05 et les gènes avec un changement de facteur log2 (log2FC)> 1 ou <-1 ont été considérés comme exprimés de manière différentielle. Les mâles et les femelles ont été comparés à chaque instant pour chaque type de cellule et condition. Les paires de contrôle (CTRL) et SOD1 ont également été testées à chaque instant et pour chaque type de cellule (DEG en phase terminale dans Supp. Tab. 1). L'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA)32 a été réalisée à l'aide du package clusterProfiler R (version 4.0.5)33,34. La taille de l'ensemble de gènes de référence était limitée à 10 à 800 gènes et le seuil de signification a été fixé à padj = 0,05. Seuls les résultats où plus d'un gène a contribué à l'enrichissement (enrichissement de base) ont été considérés comme pertinents.

Les types de cellules individuelles d'intérêt (astrocytes, microglie, oligodendrocytes) ont été analysés séparément. Les gènes mitochondriaux et ribosomiques n'ont pas été inclus dans les analyses ultérieures. Les données filtrées, normalisées, mises à l'échelle et transformées en SC ont ensuite été soumises à une PCA. Dans le cadre du contrôle qualité, plusieurs gènes ont été exclus car ils introduisaient une variabilité supplémentaire indésirable dans le clustering (Sod1, Gm8566, Cmss1, Cdk8 et lncRNAs Xist, Gm42418, Gm424181, Malat1). 16 PC pour la microglie et les astrocytes et 17 PC pour les oligodendrocytes ont été visualisés à l'aide d'UMAP et regroupés à une résolution de 0, 2 (fonctions FindNeighbors et FindClusters). Un groupe de cellules témoins mâles au point temporel de 3 M a été exclu des sous-ensembles d'astrocytes et d'oligodendrocytes, car il exprimait des gènes marqueurs potentiellement liés au stress (par exemple, Cdkn1a, Fkbp5), qui auraient pu être induits lors de la préparation de l'échantillon (Supp. Fig. 2).

Les marqueurs des sous-clusters ont été identifiés à l'aide du test de Wilcoxon par défaut dans la fonction FindAllMarkers (au moins 10 % de cellules dans un cluster exprimant le marqueur donné, log2FC > 0,25, Supp. Tab. 3). L'identité des sous-groupes a été déterminée par comparaison avec les signatures génétiques disponibles de divers sous-types cellulaires précédemment décrits à l'aide de la fonction AddModuleScore et par annotation manuelle basée sur les gènes marqueurs calculés. Les signatures d'expression génique de référence ont été tirées de Habib et al.5 (astrocytes Gfap-Low et Gfap-High), Sala Frigerio et al.4 (ARM, IRM) et Marques et al.35 (MFOL1/2, MOL2, MOL5/6 ). L'état intermédiaire des astrocytes a été visualisé à l'aide d'un ensemble de gènes contenant des marqueurs calculés du cluster 2 et des marqueurs d'état de transition publiés par Habib et al.5. La signature de la microglie homéostatique résulte de la combinaison de marqueurs homéostatiques mentionnés dans Keren-Shaul et al.3, Mathys et al.36 et Butovsky et Weiner37. Les 30 premiers gènes ont été utilisés pour la projection dans les astrocytes, et 20 gènes ont été utilisés dans la microglie et les oligodendrocytes. Les nombres de cellules entrant dans l'analyse d'expression différentielle (DEA) et l'analyse de sous-population sont fournis dans Supp. Languette. 4.

Premièrement, nous avons étudié les changements phénotypiques attendus liés à la maladie, caractéristiques du modèle animal utilisé dans cette étude. Notre objectif était d'évaluer les principaux tournants de la maladie et de caractériser son évolution.

Pour étudier le phénotype, nous avons utilisé deux types de tests comportementaux : le test de suspension de grille métallique et le test de performance rotarod. Nous avons testé des groupes comparables d'animaux porteurs de la mutation SOD1 (G93A) (SOD1) et des animaux témoins (CTRL) avec un nombre pair de mâles et de femelles dans chaque groupe. Au début de la période d'essai (1 mois), tous les animaux ont effectué pendant le temps maximum (180 s) les deux essais (voir section "Méthodes"). Les différences entre les animaux CTRL et SOD1 ont d'abord été perceptibles dans le test de suspension de la grille métallique, où la force musculaire est principalement testée (Fig. 1a). Les différences sont devenues significatives à l'âge de deux mois, nous avons donc considéré ce point comme un début. Les performances ont ensuite lentement décliné jusqu'à une chute brutale à trois mois, signalant le début de la phase symptomatique. Cette étape, accompagnée d'une baisse encore plus importante des performances, a duré environ un mois, après quoi les animaux ont atteint le stade terminal marqué par des fonctions motrices gravement altérées. La diminution de la coordination motrice des animaux mesurée par le rotarod (Fig. 1c) n'était significative qu'au stade terminal.

L'évaluation de la pathologie corticale par les tests comportementaux et l'immunohistochimie. (a) Le test du fil suspendu a confirmé le déclin de la motricité chez les animaux SOD1 au cours de la progression par rapport aux CTRL. ( b ) Les résultats du test du fil suspendu comparant les animaux SOD1 divisés en fonction du sexe ont révélé des différences phénotypiques dans l'apparition. ( c ), ( d ) Les résultats du rotarod comparant les animaux CTRL et SOD1 n'ont pas révélé de changements significatifs dans la progression. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test post-hoc de Holm-Sidak, les barres d'erreur représentant SEM. *padj ≤ 0,05, **padj ≤ 0,01, ***padj ≤ 0,001. n indique le nombre d'animaux performants.

En étudiant les performances SOD1 masculines par rapport aux femmes, le test de suspension de la grille métallique a révélé des différences dans l'apparition des symptômes et la progression en général (Fig. 1b). L'apparition chez les mâles est apparue plus tôt, et globalement moins performante que les femelles, ce qui est en accord avec la pathologie humaine38. Cependant, malgré l'apparition tardive, les performances des femmes au stade symptomatique ont diminué plus rapidement que celles des hommes, ce qui a entraîné des résultats similaires pour les deux sexes au stade terminal. Les mesures au rotarod n'ont pas révélé de différences significatives liées au sexe dans la coordination motrice au cours de la progression.

Ainsi, les tests comportementaux ont confirmé les caractéristiques du modèle, identifié les différences liées au sexe et déterminé les quatre principaux moments de la maladie, que nous avons pris en compte dans les expériences suivantes.

L'expérience scRNA-seq a été conçue comme suit (Fig. 2a) : des souris CTRL et SOD1 ont été sacrifiées à quatre moments, représentant les principaux stades de la maladie, avec deux mâles et deux femelles utilisés par condition à chaque moment. Toutes les suspensions cellulaires ont été préparées à partir du tissu cortical moteur et somatosensoriel et ont été enrichies pour trois types de cellules gliales - astrocytes, microglie et oligodendrocytes - à l'aide de FACS.

Aperçu de l'expérience de séquençage d'ARN unicellulaire. (a) Un schéma résumant le processus de l'expérience de séquençage. (Créé avec BioRender.com) (b) Une visualisation de parcelle UMAP des grappes de cellules identifiées, contenant des cellules de tous les échantillons. ASTRO n = 5536, MG n = 8429, OLIGO n = 6180, PVM n = 434, OPC n = 165, COP n = 98, PERI n = 395, ENDO n = 235, ENDO/PERI n = 108, total n = 21 580. ( c ) Une visualisation de la représentation des grappes et de la prévalence des cellules gliales ciblées dans les conditions et les sexes. CTRL n = 7646, SOD1 n = 12 499, femme n = 10 246, homme n = 9899. ( d ) Une liste de gènes marqueurs canoniques utilisés pour l'identification des grappes de cellules. ASTRO—astrocytes, MG—microglie, PVM—macrophages périvasculaires, OPC—cellules précurseurs d'oligodendrocytes, COP—précurseurs d'oligodendrocytes engagés, OLIGO—oligodendrocytes, PERI—péricytes, ENDO—cellules endothéliales.

Les données scRNA-seq ont suivi un contrôle de qualité initial, un filtrage et un regroupement, et l'ensemble résultant de cellules individuelles a été annoté à l'aide de l'expression de gènes marqueurs canoniques de populations de cellules gliales individuelles (Fig. 2b, d). Comme prévu, les clusters les plus nombreux dans l'ensemble de données ont été identifiés comme étant des astrocytes (Aqp4, Aldh1l1, Gjb6), des microglies (Cx3cr1, Aif1) et des oligodendrocytes (Mobp, Apod). Les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) et les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (COP) engagées se sont regroupées séparément des oligodendrocytes matures qui prévalaient dans l'ensemble de données. Les gènes marqueurs de ces populations se chevauchaient partiellement, indiquant une maturation progressive des OPC en oligodendrocytes (Emid1, Pdgfra, Sox6, Vcan, Plp1, Cldn11 et autres). De plus, les macrophages périvasculaires, les péricytes et les cellules endothéliales étaient présents en minorité.

Chaque cellule s'est vu attribuer une identité sexuelle basée sur l'expression des gènes associés aux chromosomes X et Y. Les cellules qui ne remplissaient pas les critères de détermination du sexe (voir Méthodes, Supp. Fig. 1a, b) ont été exclues des analyses ultérieures. Aucun amas cellulaire n'était surreprésenté spécifiquement dans CTRL ou SOD1, ni dans les échantillons masculins ou féminins, confirmant la robustesse de la préparation cellulaire (Fig. 2c). De plus, la faible proportion de lectures mitochondriales et l'activation minimale des gènes précoces immédiats ont encore validé la qualité des données (Supp. Fig. 1c, d). Dans l'ensemble, nous avons identifié avec succès les populations de cellules ciblées dans l'ensemble de données et observé leurs proportions égales dans les conditions et les sexes.

Pour fournir une vue générale des modifications de l'expression génique chez les souris SOD1, chacun des principaux types de cellules a été soumis à une PCA en tant que pseudo-volume (Fig. 3a). L'analyse a révélé une altération mineure entre les échantillons CTRL et SOD1 chez les deux sexes au cours de la progression de la maladie. Le premier décalage apparent entre les échantillons est apparu à l'âge de quatre mois dans la microglie et les oligodendrocytes, suggérant leur réaction à une pathologie de type SLA. Les astrocytes SOD1, fréquemment signalés comme étant activés dans SOD1 (G93A) et d'autres modèles d'ALS14,18,19,39, sont restés inchangés et regroupés avec les échantillons CTRL. Notamment, le regroupement a montré un déplacement des points de données masculins âgés de trois mois (3 M). Ceci était le plus important dans les astrocytes, où il représentait la source la plus élevée de variabilité (reflétée par la séparation dans PCA1). En explorant la source de la variabilité, nous avons identifié un groupe mineur de cellules dans les astrocytes et les oligodendrocytes, qui n'était présent que chez les mâles CTRL de 3 M (Supp. Fig. 2). Le cluster a été caractérisé par l'expression des gènes liés au stress Cdkn1a et Fkbp5, qui avaient les valeurs les plus extrêmes de charges dans les composants principaux respectifs (PC) dans l'analyse pseudobulk, confirmant l'effet du cluster sur le déplacement de 3 M CTRL mâle points de données. Comme la présence du cluster avait un effet négligeable sur une analyse ultérieure, nous l'avons considéré comme un artefact technique du traitement des échantillons et l'avons supprimé de l'ensemble de données. Cette découverte, cependant, a montré la puissance de l'analyse unicellulaire pour caractériser même des changements mineurs dans les sous-populations cellulaires, qui pourraient autrement être difficiles à interpréter dans l'analyse en vrac traditionnelle.

L'analyse de l'expression pseudo-globale et différentielle ne révèle que des changements mineurs dans l'expression des gènes. ( a ) Comparaison de regroupement de PCA pseudobulk d'échantillons masculins et féminins montrant une réaction commune à la pathologie en cours dans la microglie et les oligodendrocytes à 4 M. ( b ) Une visualisation des quelques gènes exprimés de manière différentielle trouvés dérégulés chez les hommes et les femmes dans tous les types de cellules à Point de temps de 4 M. Xist distingue clairement les cellules femelles, alors que Eif2s3y et Uty sont tous deux exprimés par le chromosome mâle Y. (c) Les résultats de la DEA comparant les échantillons CTRL et SOD1 4 M montrent un nombre limité de gènes régulés positivement et négativement au stade final. ( d ) Courbes d'enrichissement visualisant les résultats de la GSEA à 4 M. Un ensemble de gènes de référence a été enrichi parmi les gènes régulés à la baisse dans les oligodendrocytes. L'analyse des termes GO a montré que les composants mitochondriaux étaient enrichis parmi les gènes régulés positivement dans les oligodendrocytes et la microglie.

Sur la base des différences liées au sexe dans les tests comportementaux (Fig. 1a – d), nous avons examiné les variations potentielles de l'expression génique associée à la SLA entre les sexes par DEA et comparé les cellules mâles et femelles pour CTRL et SOD1 séparément. L'analyse n'a donné que quelques DEG basés sur les seuils définis de |log2FC|> 1 et padj < 0,05. Le gène Xist du chromosome X était significativement régulé positivement chez les femelles dans les trois types de cellules, quel que soit le génotype. Le gène Xist joue un rôle majeur dans la compensation du dosage génique chez les femelles en faisant taire l'un des chromosomes X, et n'est donc exprimé que dans les cellules femelles40. Deux gènes codés par le chromosome Y (Eif2s3y, Uty) étaient régulés positivement chez les mâles, mais la différence dans leur expression ne dépassait que le seuil log2FC dans les astrocytes (Fig. 3b). En dehors de ceux-ci, aucun autre gène dérégulé lié à la progression de la pathologie et au sexe n'a été trouvé dans nos données.

Pour étudier les changements transcriptionnels liés à la maladie, nous avons effectué la DEA sur les comparaisons d'échantillons CTRL et SOD1 à chaque instant et pour chaque type de cellule, en considérant les mâles et les femelles ensemble. Le gène Sod1 était le seul DEG significativement régulé positivement à tous les stades mesurés de la maladie, y compris le stade terminal, comme le montrent les Fig. 3c et Supp. Languette. 1 (|log2FC|> 1, padj < 0,05), confirmant la validité du modèle SOD1(G93A). D'autres gènes dérégulés étaient principalement des transcrits non codants ou ribosomiques qui échappaient au contrôle de qualité. De plus, les échantillons CTRL 4 M ont été marqués par une expression accrue des gènes Cdk8 et Cmss1 dans tous les types de cellules. Ces deux gènes ont été identifiés dans l'analyse ultérieure comme des facteurs de confusion affectant négativement les résultats de sous-regroupement (Supp. Fig. 2a, b). Par conséquent, ils ont été considérés comme des facteurs de biais sans lien avec la pathologie de type SLA. Ensemble, ces résultats montrent une variation minimale de l'expression génique liée à la progression de la pathologie dans le cortex de la souris SOD1 (G93A), quel que soit le sexe, avec l'indication de changements subtils dans la microglie et les oligodendrocytes dans la phase tardive de la maladie.

Pour étudier la signification biologique potentielle des changements minimes dans l'expression des gènes détectés par DEA, nous avons utilisé le GSEA32 concentré sur le point de temps 4 M le plus affecté. Comme la GSEA considère l'expression de tous les gènes, indépendamment des seuils de log2FC ou de la valeur p, elle permet de trouver tout processus dérégulé même si le changement des gènes individuels est mineur.

Tout d'abord, nous avons utilisé une approche de méta-analyse et collecté les signatures génétiques des cellules gliales affectées par la mutation SOD1 à partir de 15 études transcriptomiques publiées au cours des 20 dernières années (Supp. Tab. 2). Cet ensemble comprend des données principalement dérivées de la moelle épinière du modèle SOD1(G93A). À l'aide de GSEA, nous avons détecté l'enrichissement d'un seul ensemble de gènes qui a été récemment rapporté par Liu et al.15 comme régulé à la baisse dans les oligodendrocytes du tronc cérébral chez des souris âgées de 100 jours. En concordance, nos résultats ont montré un enrichissement négatif en oligodendrocytes (NES = - 1, 32, padj = 6, 3 × 10 - 3; NES - score d'enrichissement normalisé; Fig. 3d), indiquant des changements faibles mais significatifs dans les oligodendrocytes corticaux 4 M SOD1. Aucun ensemble de gènes n'a été trouvé enrichi pour la microglie ou les astrocytes.

En plus de la méta-analyse, nous avons également recherché des termes Gene Ontology (GO) 41,42 enrichis dans nos données. Deux termes activés liés aux mitochondries se sont avérés être régulés à la hausse dans notre ensemble de données : enveloppe mitochondriale dans les oligodendrocytes (NES = 1,11, padj = 8,2 × 10–3) et complexe contenant des protéines mitochondriales dans la microglie (NES = 1,73, padj = 1,1 × 10–6) (Fig. 3d). À l'appui de nos données, le dysfonctionnement mitochondrial a été largement discuté comme l'un des facteurs contribuant à la pathologie de la SLA, non seulement en relation avec le gène mutant Sod1, mais également avec d'autres perturbations génétiques liées à la SLA (revue dans Jankovic et al.43) .

Pris ensemble, malgré le faible nombre de DEG, nous avons identifié des changements subtils dans la fonction des mitochondries dans les oligodendrocytes corticaux et la microglie. Cependant, compte tenu du nombre de termes enrichis et de leur importance, la sévérité du dysfonctionnement est plutôt faible.

Comme les analyses pseudobulk n'ont révélé que de subtiles variations dans l'expression génique de la glie corticale SOD1 (G93A), nous avons émis l'hypothèse que les changements pathologiques pourraient être représentés par une petite fraction de cellules, cachées au niveau de la population. Par conséquent, nous avons mené une analyse approfondie des sous-groupes dans le but d'identifier les sous-populations jouant potentiellement un rôle dans la progression de la maladie.

En commençant par les astrocytes, nous avons identifié trois groupes présents dans les échantillons CTRL et SOD1 dans une proportion similaire (Fig. 4a). Pour annoter ces clusters, nous avons calculé leurs gènes marqueurs (Supp. Tab. 3) et visualisé les signatures géniques des sous-types astrocytaires décrits par Habib et al.5 dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). L'étude a identifié deux sous-populations similaires d'astrocytes exprimant des marqueurs de réactivité -⁠ Gfap-High et DAA. Alors que Gfap-high était présent dans les témoins et dans les échantillons AD, les AAD étaient uniques au modèle AD, et les auteurs ont suggéré leur rôle potentiel dans la progression de la maladie. Les gènes marqueurs du cluster 3 dans nos données chevauchaient partiellement les marqueurs du cluster Gfap-High (par exemple, les gènes Mt1, Mt2, Id3, Cd9, Vim), mais nous n'avons pas détecté les DAA spécifiquement dans les échantillons SOD1. Il convient de noter que les niveaux d'expression de Gfap et Vim étaient faibles, suggérant une réaction pathologique limitée des astrocytes dans le cortex des souris mutantes SOD1 (G93A). Cette constatation est conforme aux résultats de l'analyse pseudobulk, ne montrant aucun changement dans les astrocytes. Le cluster 1 partageait des gènes communs avec les astrocytes Gfap-low (par exemple Luzp2, Trpm3), et le cluster 2 restant exprimait des marqueurs des clusters Gfap-High et Gfap-Low, représentant donc un cluster d'état intermédiaire.

L'analyse de la sous-population a révélé une sous-population unique d'oligodendrocytes dans les échantillons de SOD1. Visualisation UMAP de sous-populations d'astrocytes (n = 5292) (a), de microglie (n = 8414) (b) et d'oligodendrocytes (n = 5876) (c) divisés en conditions CTRL et SOD1 (à gauche), y compris les cellules des quatre Points de temps. Les signatures d'expression génique des sous-populations décrites précédemment sont projetées sur UMAP (milieu-haut). Une liste de marqueurs de cluster représentatifs utilisés pour leur annotation (au milieu en bas). Proportions de sous-populations dans CTRL et SOD1 (à droite), y compris les cellules des quatre points dans le temps. ( d ) Visualisation UMAP des oligodendrocytes CTRL et SOD1 divisés en fonction de l'âge (1 M : n = 682, 2 M : n = 1 697, 3 M : n = 1 430, 4 M : n = 2 067). Le graphique à barres montre les proportions de sous-populations à chaque instant.

Les microglies ont été regroupées en quatre groupes, comme indiqué dans le graphique UMAP de la figure 4b. Le cluster 1 était caractérisé par l'expression de marqueurs homéostatiques3,36,37. Les signatures génétiques de la microglie dans les clusters 2 et 3 ressemblaient au profil d'expression de l'ARM, décrit dans un modèle de MA, mais également dans une proportion plus faible dans un cerveau sain3,4. Ces microglies activées régulent de manière caractéristique à la baisse les gènes homéostatiques tels que Cx3cr1, P2ry12 et Sall1, ce qui est également perceptible dans nos données (Fig. 4b). De plus, le groupe 3 était marqué par une expression plus élevée d'Apoe, qui est un régulateur majeur du phénotype neurodégénératif microglial44. Le groupe 4 représentait IRM4 et se distinguait clairement par l'expression de Ifit2, Ifit3 et Ifitm3, les gènes impliqués dans la voie de réponse à l'interféron. Cependant, la proportion d'IRM était très faible dans les deux conditions. Néanmoins, nous avons détecté une petite augmentation de la sous-population de microglie activée dans les échantillons SOD1 (cluster 2), suggérant une activation de départ de la microglie en réponse à des stimuli pathologiques.

Les oligodendrocytes formaient quatre grappes (Fig. 4c). Le groupe 1 partageait une signature d'expression génique similaire avec les oligodendrocytes formant de la myéline (MFOL) décrits par Marques et al.35, y compris l'expression des gènes Mal, Plp1, Mog et Opalin. Ces cellules étaient principalement présentes au moment d'un mois (1 M) (Fig. 4d), qui coïncide avec la myélinisation étendue chez les rongeurs au cours des premières semaines après la naissance45. Le cluster 2 représente les oligodendrocytes matures (MOL2) exprimant Klk6, mais aussi le marqueur oligodendrocyte mature Apod et les gènes typiques des cellules myélinisantes Pmp22, S100b et Apc7,35,46. Floriddia et al.7 ont rapporté que la population MOL2 était plus abondante dans la substance blanche de la moelle épinière, mais aussi dans une moindre mesure dans le cortex35. Les proportions dans les deux conditions étaient similaires pour les clusters 1 et 2. Quant aux clusters 3 et 4, ils ont montré une expression accrue de plusieurs gènes trouvés dans les populations d'oligodendrocytes matures MOL5/67,35. Fait intéressant, le cluster 4 était présent presque exclusivement dans les échantillons SOD1 (Fig. 4d) et était caractérisé par une expression plus élevée d'Apoe et d'Il33. Il33 est régulé positivement dans les oligodendrocytes et les astrocytes dans les lésions et peut être libéré par des cellules stressées ou endommagées. Il a un effet anti-inflammatoire et favorise l'activation de la microglie (revu dans Sun et al.47). La régulation à la hausse de l'Ill33 a déjà été rapportée dans les oligodendrocytes associés à la maladie dans un modèle murin d'AD48,49. Apoe a été identifié comme un gène marqueur des oligodendroglies immunitaires (ImOLG)50, qui ont été enrichis dans les lésions de sclérose en plaques, suggérant leur rôle dans la démyélinisation chronique et les tentatives continues de remyélinisation51. Ainsi, nous émettons l'hypothèse que le cluster 4 représente un état endommagé ou réactif des oligodendrocytes, répondant aux stimuli pathologiques dans le cortex 4 M SOD1. Il est tentant de spéculer si la petite augmentation du nombre de microglies activées et éventuellement le passage à l'état intermédiaire des astrocytes que nous avons observés dans la SOD1 (Fig. 4a, b, respectivement) pourraient être une réponse aux oligodendrocytes endommagés/activés. Ce type d'interaction entre les états associés à la maladie des cellules gliales a été récemment décrit dans AD52, ainsi que dans ALS2.

Dans l'ensemble, nous avons pu identifier plusieurs sous-populations d'astrocytes, de microglies et d'oligodendrocytes, et nous avons reconnu les modèles d'expression génique de sous-types cellulaires spécifiques, précédemment décrits. Cependant, contrairement à nos attentes, nous n'avons détecté aucune sous-population associée à la maladie dans les échantillons de SOD1, à l'exception des oligodendrocytes endommagés/activés.

Les résultats de l'analyse scRNA-seq ont suggéré des changements mineurs dans la glie corticale du modèle de souris SOD1 (G93A). Pour approfondir et valider cette conclusion, nous avons effectué une analyse immunohistochimique de la glie dans le cortex somatosensoriel moteur et primaire (la région identique utilisée pour le séquençage) au point temporel de 4 M, lorsque les changements phénotypiques sont les plus prononcés. Les zones imagées dans les zones d'intérêt sont représentées sur la figure 5a. Comme les changements morphologiques sont bien décrits dans la moelle épinière, nous avons également coloré la région lombaire de la moelle épinière au stade terminal (4 M) et utilisé ces images comme référence pour la gliose avancée chez nos animaux.

L'immunohistochimie (a) Un dessin animé supérieur représente 12 zones numérisées pour l'étude des changements morphologiques et la quantification de l'APC et du CC3. Le dessin animé inférieur montre 24 zones numérisées pour l'analyse MBP. ( b ) L'analyse de fluorescence n'a révélé aucune différence significative de morphologie entre les astrocytes corticaux chez les animaux SOD1 (n = 6) et CTRL (n = 6). ( c ) Des images représentatives de la coloration ALDH1L1 dans le cortex et la moelle épinière comparant les astrocytes montrent une différence morphologique entre SOD1 et CTRL dans la moelle épinière mais aucune différence notable dans le cortex. ( d ) Les résultats de l'analyse Sholl ont indiqué une complexité de microglie très similaire dans les échantillons CTRL (n = 6) et SOD1 (n = 6). Les masques Scholl avec des rayons concentriques rouges représentent une microglie à seuil unique telle qu'elle a été utilisée pour l'analyse. (e) Des images représentatives de tranches corticales et spinales colorées avec IBA1 montrent une morphologie amibienne évidente de la microglie spinale, mais seulement des changements morphologiques subtils représentés par des extrémités bulbeuses (voir gros plan) dans le cortex. ( f ) La quantification de MBP dans le cortex a révélé une différence insignifiante entre SOD1 (n = 6) et CTRL (n = 6). Le nombre de cellules APC + était cohérent entre SOD1 (n = 3) et CTRL (n = 3) et le nombre de cellules APC + co-colorées avec CC3 utilisé comme marqueur d'apoptose dans les oligodendrocytes est également resté similaire, suggérant l'absence d'oligodendrocyte apparent dégénérescences. ( g ) Images représentatives des barres d'échelle de coloration MBP, APC et CC3, 20 μm. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test t non apparié. Les barres d'erreur représentent SEM. n indique le nombre d'animaux utilisés.

Les astrocytes ont été colorés à l'aide du marqueur ALDH1L1, ce qui a permis l'inspection de la morphologie cellulaire entière, y compris les processus. L'astrogliose, un changement morphologique marqué par l'élargissement du corps cellulaire et des processus raccourcis et épaissis, est une réponse caractéristique des astrocytes dans les états pathologiques, et elle a été bien décrite dans la moelle épinière de la SLA13,14. Dans le cortex, nous avons effectué une analyse de fluorescence afin de trouver d'éventuelles différences morphologiques (Fig. 5b), mais l'analyse a montré des valeurs de fluorescence très similaires des astrocytes SOD1 et CTRL, suggérant qu'il n'y a pas d'élargissement cellulaire associé à l'activation. La morphologie similaire peut être vue sur la figure 5c en comparaison avec les astrocytes dans les cornes ventrales de la région lombaire spinale, qui présentaient un corps élargi avec des processus distinctement raccourcis. Les résultats de l'analyse de fluorescence s'alignent sur peu ou pas de changement détecté dans les astrocytes au niveau de l'expression génique.

La microglie, comme les astrocytes, change de morphologie en réponse à des stimuli pathologiques. Ils rétractent les processus et adoptent une forme amibienne spécifique, typique de leur état activé. Pour visualiser la microglie, nous avons utilisé l'anticorps IBA1 et coloré à la fois le cortex et la moelle épinière lombaire à des fins de comparaison. L'analyse Sholl que nous avons utilisée pour évaluer les changements de morphologie (Fig. 5d) est fréquemment effectuée pour quantifier la complexité de l'arborisation des cellules. L'analyse a confirmé que la morphologie de la microglie corticale SOD1 ne diffère pas significativement des animaux CTRL. Nous n'avons pas détecté de processus plus courts ou de ramification réduite, ce qui suggérerait un phénotype activé. Cependant, au cours de l'analyse, nous avons remarqué que certaines extrémités des processus semblaient bulbeuses et élargies (Fig. 5e). Ces structures, appelées extrémités bulbeuses, apparaissent comme la première réaction de la microglie après une blessure53 et peuvent représenter une phase initiale d'activation de la microglie observée dans les données transcriptomiques. La microglie SOD1 dans les cornes ventrales de la moelle épinière, d'autre part, affiche la forme amibienne typique avec des processus très courts et épaissis associés à l'activation.

L'analyse précédente a identifié un cluster d'oligodendrocytes spécifiques de SOD1 (cluster 4) suggérant qu'une certaine partie des cellules est apoptotique, nous nous sommes donc concentrés sur les changements d'expression des protéines liés à la démyélinisation chronique, à la nécrose ou à l'apoptose. En conséquence, nous avons coloré la protéine basique de la myéline (MBP) - un marqueur de la myélinisation, la polypose adénomateuse du colibri (APC) - un marqueur des oligodendrocytes adultes et la caspase 3 clivée (CC3) - un marqueur apoptotique. La quantification de l'intensité du signal MBP ainsi que du nombre d'oligodendrocytes APC + dans le cortex des animaux SOD1 a exclu les processus de démyélinisation car il n'y avait pas de diminution significative des cellules MBP ou APC + par rapport aux CTRL (Fig. 5f). De même, la co-coloration de CC3 avec APC n'a pas révélé une abondance différente d'oligodendrocytes CC3 + dans la SOD1 ou les CTRL, suggérant un taux d'apoptose similaire (Fig. 5f). La coloration MBP et l'image représentative d'une cellule positive pour APC et CC3 peuvent être trouvées sur la figure 5g. Collectivement, les données n'ont montré aucune démyélinisation ou dégénérescence significative des oligodendrocytes, il est donc probable que le cluster 4 spécifique de SOD1 identifié dans le scRNA-seq chez les animaux 4 M ne représente pas des cellules mourantes ou endommagées.

Pris ensemble, nous n'avons détecté aucun changement morphologique profond dans la glie corticale des souris SOD1. Les oligodendrocytes n'ont pas montré d'augmentation de la mort cellulaire ou de la perte de protéine MBP, ce qui suggère que sa fonction est maintenue dans le cortex des souris SLA.

La SLA est une maladie neurodégénérative dévastatrice avec une progression rapide et aucune stratégie de traitement efficace. Bien qu'elle soit principalement reconnue comme une maladie du motoneurone, les autres types de cellules, y compris les cellules gliales, contribuent à la progression de la maladie et représentent ainsi une cible potentielle pour de futures thérapies. Dans le passé, de multiples modèles expérimentaux ont été développés pour comprendre les mécanismes de la maladie, ainsi que pour faciliter la recherche de cibles thérapeutiques. Parmi eux, le modèle de souris SOD1 (G93A) occupe la première place en tant que souche de souris la mieux caractérisée utilisée dans la recherche actuelle sur la SLA. Malgré son application à long terme, l'effet des changements pathologiques dans différentes régions du SNC n'est pas encore entièrement compris.

L'effet pathologique sur le cortex est particulièrement intéressant en raison de son rôle dans la planification, le contrôle et l'exécution des mouvements volontaires, qui sont gravement affectés par la SLA. Des changements pathologiques dans le cortex des patients SLA ont été signalés depuis la première description de la maladie en 1869, et la surveillance des anomalies structurelles corticales est devenue une procédure de diagnostic standard de la SLA54. Parallèlement à la mort corticale des MN, des changements dans la glie ont également été observés, notamment la microgliose11,55,56,57, accompagnée de la signature d'expression génique de type DAM56, la démyélinisation8 et le changement de la fonction des oligodendrocytes de myélinisation à neuro-soutien57.

Alors que les changements sont bien documentés chez l'homme, on en sait moins sur l'effet de la pathologie de type SLA sur le cortex des modèles SOD1. Dans le modèle SOD1(G93A), la dégénérescence corticale du MN a été observée précocement par Özdinler et al.17 et d'autres, ainsi que les modifications de la glie18,19,20. Il a été démontré que les astrocytes réactifs dans le cortex SOD1 (G93A) diffèrent de leurs homologues spinaux, tout en conservant un effet toxique sur les neurones18,19,58. Cependant, Gomes et al.19 n'ont également signalé aucun changement significatif de l'expression génique dans la microglie ou les oligodendrocytes. De plus, d'autres ont suggéré que la pathologie dans le modèle SOD1 était limitée aux seuls motoneurones spinaux et bulbaires, n'affectant pas le cortex moteur21. Ainsi, de telles données opposées soulèvent des questions quant à la mesure dans laquelle le cortex est affecté dans le modèle de souris SOD1 et dans quelle mesure ce modèle récapitule la pathologie corticale chez l'homme.

Pour combler cette lacune dans les connaissances, nous avons appliqué le séquençage d'ARN unicellulaire soutenu par l'immunohistochimie pour détecter les changements d'expression génique, la présence de populations de cellules associées à la maladie et les modifications morphologiques ou pathologiques dans la glie corticale accompagnant la pathologie de type SLA dans la SOD1( G93A) modèle de souris. Le phénotype de type SLA a été confirmé par des tests comportementaux, y compris les différences liées au sexe dans la progression de la maladie, comme l'ont rapporté McCombe et Henderson38. Les résultats de scRNA-seq axés sur la glie ont révélé des changements mineurs dans la microglie et les oligodendrocytes, et n'ont montré aucun changement significatif lié à la SLA dans les astrocytes, ce qui contredit plusieurs études rapportant le phénotype réactif des astrocytes18,19,58. Bien que le seul gène significativement dérégulé dans le modèle SOD1 (G93A) soit Sod1, la GSEA a indiqué le dysfonctionnement mitochondrial dans la microglie et les oligodendrocytes. Des changements similaires ont récemment été observés par Liu et al.15 dans les oligodendrocytes isolés du tronc cérébral de souris SOD1 âgées de 100 jours, suggérant la possible dérégulation des voies énergétiques.

Comme nos données ont été générées dans le cortex moteur et somatosensoriel primaire, représentant une région terminale du tractus corticospinal affectée par la SLA, elles permettent de répondre aux questions fondamentales concernant le site d'origine et la direction de la progression de la SLA. Actuellement, il existe deux hypothèses, toutes deux étayées par des sources de données (examinées par van den Bos et al.59). L'hypothèse de la « mort vers l'avant » suggère que la SLA prend naissance dans le cortex et se propage vers les MN de la colonne vertébrale. D'un autre côté, l'hypothèse du « retour en arrière » propose que la SLA commence dans les muscles ou les jonctions neuromusculaires. Compte tenu du phénotype avancé de type SLA des souris SOD1 en phase terminale et des changements plus prononcés dans le tronc cérébral et la moelle épinière observés ailleurs, les changements plus légers dans le cortex indiqués par nos données sont plus en faveur de l'hypothèse du « mourir ». chez la souris SOD1(G93A). Fait intéressant, cela contraste avec un rapport de Burg et al.60, qui indique que le cortex est le point de départ de la SLA chez les souris SOD1(G86R). Les données contradictoires pourraient suggérer un effet différentiel de mutations ponctuelles spécifiques sur le caractère de la maladie, nécessitant une enquête plus approfondie.

De nombreux rapports précédents explorant l'effet de la mutation SOD1 sur le cortex moteur reposaient sur la mesure du nombre limité de gènes et de protéines19,20,55, ou sur l'analyse de la population globale de cellules18,61. Cela a par conséquent diminué la sensibilité de l'analyse et limité l'interprétabilité des données. Dans cette étude, nous avons utilisé le scRNA-seq à haut débit, permettant une analyse approfondie des populations de petites cellules qui ne peuvent pas être distinguées par des approches en masse. À l'aide de scRNA-seq, des études séminales récentes ont révélé diverses populations de glie associées à la maladie, jouant un rôle majeur dans la progression de la maladie3,4,5,6. Fait intéressant, bon nombre de ces populations sont présentes dans de multiples maladies, ce qui suggère des mécanismes communs employés par les cellules gliales en réponse à des stimuli pathologiques. Par exemple, une population de type DAM a été identifiée non seulement dans la maladie d'Alzheimer, mais aussi dans la moelle épinière de la souris SOD1(G93A)3, et dans un modèle de lésion de la moelle épinière62. Dans notre travail, nous avons recherché ces populations sans succès, ce qui a confirmé les changements minimes observés au niveau transcriptionnel de masse, ainsi que par immunohistochimie. Nous avons principalement trouvé une composition cellulaire similaire entre les animaux témoins et SOD1 (G93A), à l'exception de la microglie et des oligodendrocytes. Dans le cas des microglies, nous avons observé une petite augmentation de la proportion des microglies activées, suggérant une phase de démarrage de leur activation. Les données ont été complétées par immunohistochimie révélant des extrémités bulbeuses sur des processus microgliaux. Des changements plus apparents ont été observés dans les oligodendrocytes, où l'analyse de sous-clustering a identifié l'existence d'une population unique d'oligodendrocytes, caractérisée par une expression accrue d'Apoe et d'Il33, et enrichie spécifiquement dans des échantillons de 4 M de SOD1. Considérant l'absence de perte profonde d'oligodendrocytes ou un taux d'apoptose plus élevé en immunohistochimie, nous pourrions spéculer sur le rôle actif de cette population d'oligodendrocytes dans la progression de la maladie. Ceci est également conforme aux preuves récentes suggérant le rôle actif des oligodendrocytes dans la progression de la sclérose en plaques6 et dans le vieillissement de la substance blanche63, ce qui contraste avec leur rôle passif largement accepté. Notamment, nous n'avons observé aucun schéma d'expression similaire aux oligodendrocytes associés à la maladie rapportés précédemment6, 48, 49, 50, à l'exception de l'Apoe ou de l'Il33 mentionnés ci-dessus. Cependant, cela pourrait être lié aux légers changements globaux dans l'expression des gènes observés dans nos données.

En conclusion, notre étude démontre que les cellules gliales corticales ne sont que subtilement affectées dans le modèle SOD1(G93A), même au tout dernier stade de la maladie. De plus, grâce à la puissance du scRNA-seq, nous avons montré que les oligodendrocytes participent potentiellement activement à la pathologie, soulignant l'importance d'aborder leur rôle dans les recherches futures. Enfin, à la lumière de nos résultats, nous suggérons que le modèle de souris SOD1 (G93A) ne récapitule pas entièrement la maladie humaine et nous recommandons d'utiliser un système de modèle différent pour étudier la pathologie corticale de la SLA.

Collectivement, nos résultats suggèrent que les changements pathologiques de type SLA présents dans le cortex sensorimoteur des souris SOD1(G93A) sont minimes. Il y a une discussion en cours sur le terrain pour savoir si le modèle imite complètement la maladie, y compris la pathologie survenant dans le cortex et les résultats publiés sont discutables. Nos découvertes collectives inspectant les cellules gliales à plusieurs niveaux n'ont révélé aucun changement significatif des astrocytes SOD1 et seulement des changements subtils de la microglie et des oligodendrocytes au stade final. Les changements de la microglie et des oligodendrocytes suggèrent un début d'activation lié à la pathologie, mais l'ampleur du changement ne correspond pas à la pathologie décrite dans les tissus humains. Les oligodendrocytes spécifiques de SOD1 identifiés au stade final contribuent cependant aux preuves récemment publiées faisant état de leur rôle actif dans la neurodégénérescence, rejetant largement le dogme de longue durée présentant les oligodendrocytes comme uniquement passifs dans les maladies du SNC. Cependant, malgré les signes d'activation, l'effet de la pathologie de type SLA sur les cellules gliales du cortex des souris SOD1 (G93A) est mineur et nos données fournissent des preuves à l'appui contre l'utilisation de ce modèle pour étudier la pathologie corticale de la SLA.

Les données scRNA-seq générées au cours de cette étude actuelle sont disponibles dans Gene Expression Omnibus64 du NCBI et sont accessibles via le numéro d'accession GEO Series GSE206330 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc =GSE206330).

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Les auteurs tiennent à remercier Helena Pavlikova et Marketa Hemerova pour leur excellente assistance technique et Frances Zatrepalkova pour la relecture du manuscrit. Cette étude a été soutenue par les subventions 23-05327S et 19-02046S de la Fondation tchèque des sciences, par l'Agence de subventions de l'Université Charles (numéro de subvention 158320), par le soutien institutionnel RVO 86652036, par MEYS CR (CZ.1.05/1.1.00/ 02.0109), par l'Académie tchèque des sciences (Strategy AV21, grant number VP29), par le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne sous le EJP RD COFUND- EJP N° 825575 et par EU – Next generation EU, LX22NPO5107 (MEYS). La microscopie a été effectuée au Centre de service de microscopie de l'Institut de médecine expérimentale CAS soutenu par le MEYS CR (LM2023050 Czech-Bioimaging).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Tereza Filipi et Zuzana Benesova.

Département de neurophysiologie cellulaire, Institut de médecine expérimentale, Académie tchèque des sciences, Videnska 1083, 14220, Prague, République tchèque

Tereza Filipi, Ondrej Vanatko, Jana Tureckova, Monika Kubiskova, Denisa Kirdajova & Miroslava Anderova

Deuxième faculté de médecine, Université Charles, V Uvalu 84, 15006, Prague, République tchèque

Tereza Filipi & Ondrej Vanatko

Laboratoire d'expression génique, Institut de biotechnologie CAS, BIOCEV, Prumyslova 595, 25250, Vestec, République tchèque

Zuzana Matusova, Pavel Abaffy, Sarka Benesova et Lukas Valihrach

Faculté des sciences, Université Charles, Albertov 6, 12800, Prague, République tchèque

Zuzana Matusova

Département d'informatique et de chimie, Faculté de technologie chimique, Université de chimie et de technologie, Technicka 5, 16628, Prague, République tchèque

Sarka Benesova

Département d'organisation fonctionnelle des biomembranes, Institut de médecine expérimentale, Académie tchèque des sciences, Videnska 1083, 14220, Prague, République tchèque

Jakub Zahumenski

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TF et ZM ont interprété les données, rédigé le manuscrit et préparé toutes les figures. TF, ZM, PA, OV, JT, MK et DK ont réalisé des expériences. TF, ZM, PA, BT, JT,. OV et SB ont analysé les données. JZ a écrit une macro pour l'analyse immunohistochimique. MA et LV ont conçu et supervisé l'étude. Tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance à Lukas Valihrach ou Miroslava Anderova.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Filipi, T., Matusova, Z., Abaffy, P. et al. La glie corticale chez les souris SOD1 (G93A) est subtilement affectée par la pathologie de type SLA. Sci Rep 13, 6538 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33608-y

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Reçu : 25 octobre 2022

Accepté : 15 avril 2023

Publié: 21 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33608-y

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