La RhoA du muscle lisse vasculaire neutralise la formation d'anévrisme de l'aorte abdominale en modulant l'activité de MAP4K4

Communications Biology volume 5, Article number: 1071 (2022) Citer cet article

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Si une petite GTPase RhoA joue un rôle dans la pathologie de l'anévrisme de l'aorte abdominale (AAA) n'a pas été déterminée. Nous montrons ici que l'expression de RhoA est réduite dans les lésions AAA humaines, par rapport aux zones normales. En outre, l'incidence de la formation d'AAA est augmentée chez les souris RhoA conditional knockout (cKO) spécifiques aux cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). La contractilité des anneaux aortiques et des CMLV des souris RhoA cKO est réduite et l'expression des gènes liés à la contractilité des CMLV est atténuée par la perte de RhoA. L'épuisement de RhoA active la signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAP), y compris MAP4K4, dans l'aorte et les CMLV. L'inhibition de l'activité MAP4K4 par DMX-5804 diminue la formation d'AAA. Set, une protéine de liaison à la RhoA active, fonctionne comme un activateur de MAP4K4 en séquestrant PP2A, un inhibiteur de MAP4K4, en l'absence de RhoA. En conclusion, RhoA neutralise la formation d'AAA en inhibant MAP4K4 en coopération avec Set.

L'anévrisme de l'aorte abdominale (AAA) provoque une rupture de l'aorte et une mort subite. Il s'agit donc d'une maladie vasculaire potentiellement mortelle1. L'AAA est formé par plusieurs facteurs, tels que l'altération de la génération de force des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), la dégradation et la fragmentation des fibres élastiques, la perte des CMLV médiales et l'inflammation2,3. La contractilité altérée des CMLV peut être un facteur favorisant majeur pour l'AAA. Il a récemment été démontré que les CMLV de patients atteints d'AAA avaient une contraction maximale altérée, par rapport aux CMLV témoins non pathologiques4. Pour répondre au stress mécanique, les CMLV expriment des niveaux élevés de protéines contractiles, telles que l'actine musculaire lisse α (α-SMA ou ACTA2) et la chaîne lourde 11 de la myosine musculaire lisse (MYH11), et ces cellules sont essentielles pour la stabilisation de la paroi aortique . De plus, les protéines contractiles et leurs molécules apparentées contribuent à la répartition des forces dans l'aorte en régulant les propriétés mécaniques par le lien avec la matrice extracellulaire (ECM)5. En revanche, la réduction de la génération de force CMLV améliore l'activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) et la sécrétion de cytokines/chimiokines inflammatoires6,7,8. Pour prévenir la formation d'AAA, il est important de garder les CMLV en bonne santé. Cependant, la façon dont la capacité contractile des CMLV est régulée n'est pas tout à fait claire.

RhoA est une GTPase qui est abondamment exprimée dans les CMLV9,10. L'activité de RhoA est régulée par son cycle entre la forme active liée au GTP et la forme inactive liée au GDP11. Pour activer RhoA, les facteurs d'échange de nucléotides guanine induisent la libération de GDP à partir de RhoA, entraînant la capture de GTP à partir du cytosol. RhoA activé transduit ensuite les signaux vers les effecteurs en aval12. Pour l'inactivation de RhoA, les protéines activant la GTPase (GAP) stimulent de manière robuste l'activité d'hydrolyse intrinsèque de RhoA pour hydrolyser le GTP en GDP. RhoA a de multiples fonctions dans la régulation des CMLV et contribue au soutien morphologique et au maintien de la structure aortique13. La kinase enroulée associée à Rho (ROCK), une molécule en aval de RhoA, assure la médiation de la plupart des fonctions de RhoA, y compris la dynamique de l'actine, la contraction cellulaire et la motilité cellulaire14. Les dysfonctionnements de RhoA/ROCK ont été liés à la pathogenèse de l'artériosclérose, des lésions ischémiques, de l'hypertension pulmonaire et de l'insuffisance cardiaque, conduisant au développement de maladies cardiovasculaires15. Le rôle de RhoA dans le système vasculaire par ROCK a été vigoureusement étudié. Cependant, comment RhoA elle-même dans les CMLV régule l'homéostasie de l'aorte reste incertaine.

Sur la base du contexte décrit ci-dessus, nous avons examiné les niveaux d'expression de RhoA dans les zones normales et AAA des patients atteints d'AAA, et avons constaté que le niveau était significativement réduit dans la couche médiane de la zone AAA. Pour explorer plus avant la fonction de RhoA dans les CMLV aortiques, des souris RhoA conditionnel knock-out (cKO) spécifiques aux CMLV ont été générées par le système Cre/loxP. La stimulation pharmacologique a fortement induit la formation d'AAA chez les souris RhoA cKO, par rapport aux souris témoins. La perte de RhoA dans les CMLV a diminué de manière significative la contractilité des anneaux aortiques et des CMLV et l'expression des gènes liés à la contractilité, et elle a augmenté la réponse inflammatoire et les lésions endothéliales, conduisant aux phénotypes CMLV protéolytiques et inflammatoires. Nous avons démontré que l'inhibition de la protéine kinase kinase kinase kinase 4 (MAP4K4) activée par les mitogènes par RhoA dans les CMLV était importante pour la prévention de la formation d'AAA. Notre analyse protéomique a en outre permis de clarifier le mécanisme moléculaire sous-jacent par lequel RhoA régule négativement MAP4K4.

Avant d'examiner l'expression de RhoA dans l'AAA humain, nous avons confirmé la couche médiale perturbée et la perte de fibres élastiques médiales intactes dans la paroi aortique des patients AAA par une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) et à l'élastine spécifique de Verhoeff Van Gieson (Fig. 1a, b ). L'immunohistochimie et l'immunocoloration de l'aorte ont révélé que l'expression de RhoA était nettement réduite dans la couche médiale de la zone AAA par rapport à la zone normale (Fig. 1c – f). En accord avec ces résultats, la qPCR et le transfert Western d'échantillons de paroi aortique ont montré une expression significativement réduite de l'ARNm et de la protéine RhoA dans la zone AAA (Fig. 1g – i). Ces observations indiquent que l'expression de RhoA est réduite dans l'AAA humain et suggèrent que l'expression réduite de RhoA peut être impliquée dans le développement de l'AAA. De plus, les niveaux d'expression des CMLV et des protéines marqueurs des cellules endothéliales α-SMA et CD31, respectivement, ont été réduits dans la zone AAA en raison de la perturbation des couches médiale et endothéliale de la paroi aortique, tandis que le niveau de la protéine marqueur des fibroblastes vimentine était similaire entre les zones normales et AAA (Fig. 1h, i).

a Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) des zones d'anévrisme de l'aorte normale et abdominale (AAA) dans l'aorte humaine. Les rectangles en pointillés sont agrandis et affichés en bas. b Coloration Verhoeff Van Gieson des zones normales et AAA. c Immunohistochimie de RhoA dans la zone normale et AAA de l'aorte. Les rectangles en pointillés sont agrandis et affichés en bas. d Graphique récapitulatif de l'expression de RhoA examinée en (c). n = 6 en Normal et n = 9 en AAA. e Immunomarquage de RhoA dans les zones normales et les lésions AAA. La F-actine et les noyaux ont été contre-colorés avec de la phalloïdine et du DAPI, respectivement. f Graphique récapitulatif de l'expression de RhoA examinée en (e). n = 7 en Normal et n = 12 en AAA. g Analyse qPCR pour l'ARNm de RHOA obtenu à partir de zones normales et AAA. GAPDH a été utilisé comme contrôle. n = 11 en Normal et n = 15 en AAA. h Western blot pour RhoA et d'autres protéines marqueurs dans les zones normales et AAA. GAPDH a servi de contrôle de chargement. i Graphiques récapitulatifs de l'expression relative de RhoA et d'autres protéines marqueurs examinées en (h). n = 6 en normal et n = 8 en AAA. Barres d'échelle : 500 μm (a–c) et 30 μm (e). En (d, f, g, i), les données entre les deux groupes ont été analysées par test t. ***p < 0,001 par rapport à la normale.

Pour déterminer si l'expression altérée de RhoA dans la couche médiale de l'aorte contribue au développement de l'AAA, nous avons généré des souris RhoA cKO spécifiques aux VSMC à l'aide du système Cre/loxP. Les souris RhoA cKO ont affiché une croissance normale et sont nées dans des rapports mendéliens; les souris n'ont présenté aucune différence phénotypique grossière, y compris en termes de fertilité, par rapport aux témoins de même portée. Nous avons confirmé l'absence d'expression de RhoA dans la couche médiane de l'aorte de souris RhoA cKO par coloration par immunofluorescence (Fig. 1a supplémentaire). Une étude hémodynamique a montré une fréquence cardiaque et une pression artérielle systolique (TA) similaires entre les souris témoins et RhoA cKO, au moins par un contrôle ponctuel à l'aide de la méthode du brassard de queue (Fig. 1b supplémentaire). L'aspect externe de l'aorte était clair chez les souris témoins et RhoA cKO, et l'AAA ne s'est pas formé (Fig. 1c supplémentaire). L'observation échographique n'a pas détecté de dilatation significative ni de différence de diamètre de l'aorte abdominale entre les souris témoins et RhoA cKO (Fig. 1d, e supplémentaires). De plus, la coloration HE et Verhoeff Van Gieson a montré des aortes intactes chez les souris témoins et RhoA cKO (Fig. 1f, g supplémentaires). La tropoélastine, codée par le gène Eln, et la fibrilline-1, codée par le gène Fbn1, sont les composants majeurs de la couche médiale de l'aorte et jouent un rôle dans la régulation de l'élasticité aortique16. Les niveaux d'ARNm Eln et Fbn1 étaient similaires dans l'aorte entre les deux types de souris (Fig. 1h supplémentaire). Nous avons en outre examiné la production de collagène et la réticulation du collagène dans les échantillons d'aorte de souris, qui peuvent affecter la résistance de la paroi aortique, par qPCR et dosage de l'hydroxyproline. Le niveau d'ARNm du collagène de type I α1, le composant majeur du collagène de type I, était similaire entre les aortes de souris témoins et RhoA cKO. Le dosage de l'hydroxyproline a également montré que le collagène total et le collagène réticulé étaient contenus de manière équivalente dans les aortes des deux types de souris (Fig. 1i, j supplémentaires). Ces résultats suggèrent que dans des conditions normales, la perte de RhoA dans les CMLV n'affecte pas la morphologie et la fonction de l'aorte au moins pendant les six mois après la naissance.

Il a été rapporté que l'activité de la recombinase Cre pilotée par le promoteur SM22α a été observée dans le cœur ainsi que dans les CMLV chez la souris17, et que l'inactivation du gène cible a été montrée dans le cœur de ces souris cKO18. Sur la base de ces publications précédentes, nous avons vérifié l'expression de RhoA dans le cœur d'embryons et de souris adultes. L'expression de RhoA était en fait réduite, mais pas complètement perdue, dans les cœurs en développement et adultes des souris cKO RhoA, par rapport à celles des souris témoins (Fig. 2a – d supplémentaires). Malgré l'expression réduite de RhoA dans le cœur, la contractilité et les dimensions cardiaques chez les souris adultes RhoA cKO ont été maintenues (Fig. 2e supplémentaire), ce qui suggère qu'un degré de réduction de l'expression cardiaque de RhoA chez les souris RhoA cKO n'affecte pas la fonction cardiaque.

Sur la base des résultats des souris RhoA cKO décrites ci-dessus, nous avons ensuite examiné la signification biologique de RhoA dans les CMLV sous stimulation pharmacologique. L'angiotensine II (AngII) et le β-aminopropionitrile (BAPN) ont été administrés à des souris témoins et RhoA cKO à l'aide de mini-pompes osmotiques pendant 4 semaines pour induire un AAA. Aucune différence de poids corporel, de fréquence cardiaque et de pression artérielle systolique mesurée par la méthode du brassard de queue n'a été observée entre les groupes lors de l'administration d'AngII et de BAPN (Fig. 2a). Cependant, l'incidence de la formation d'AAA était significativement plus élevée chez les souris RhoA cKO que chez les souris témoins (tableau 1 et figure 2b). Nous avons ensuite analysé les souris témoins dans lesquelles l'AAA s'est formé et avons constaté que l'expression de RhoA était remarquablement réduite dans la zone AAA par rapport à la zone normale (Fig. 3a – c supplémentaire), ce qui suggère l'importance de RhoA pour la prévention de l'AAA. Bien que la longueur de l'aorte ne soit pas différente entre les souris témoins et RhoA cKO (Fig. 2c), le diamètre de l'aorte abdominale mesuré par échographie était significativement plus grand chez les souris RhoA cKO que chez les souris témoins (Fig. 2d, e). L'analyse histologique par coloration HE et Verhoeff Van Gieson a montré que la perturbation et la dégradation de la lame élastique médiale de l'aorte étaient plus graves chez les souris RhoA cKO que chez les souris témoins (Fig. 2f – h). De plus, les niveaux d'ARNm d'Eln et de Fbn1 ont été significativement réduits après la perfusion d'Ang II et de BAPN chez les souris RhoA cKO par rapport aux souris témoins (Fig. 2i). Des études antérieures ont suggéré qu'une augmentation anormale de l'agrégation de protéoglycanes dans l'aorte peut perturber les interactions cellule-matrice, compromettre la mécanodétection aortique et l'intégrité structurelle, et peut être une caractéristique de la dégénérescence médiale de l'aorte19,20,21. Par conséquent, nous avons effectué une immunocoloration pour détecter l'expression de l'aggrécane dans l'aorte et avons constaté que l'expression était significativement régulée à la hausse et accumulée au site de la rupture aortique chez les souris RhoA cKO (Fig. 2j). Ensemble, ces résultats suggèrent que RhoA dans les CMLV a un rôle protecteur contre la stimulation pour former des AAA.

a Modifications du poids corporel et de l'hémodynamique avant (semaine 0) et après le traitement par AngII et BAPN. n = 14, chaque groupe. b Aspect externe de l'aorte avec le cœur et les reins extraits après le traitement de 4 semaines. Les flèches indiquent un AAA formé. c Longueur de l'aorte de la valve aortique à la bifurcation de l'artère iliaque commune. d Observation échographique de l'aorte abdominale, délimitée par des pointillés jaunes, après le traitement. e Graphique récapitulatif du diamètre de l'aorte abdominale. n = 6, chaque groupe. f Coloration HE de l'aorte. g Verhoeff Van Gieson coloration de l'aorte. h Graphique récapitulatif du degré de dégradation de l'élastine analysé en (g). n = 5, chaque groupe. i Analyse qPCR des gènes liés à l'élasticité aortique. n = 13 dans Control et n = 10 dans RhoA cKO pour Eln, et n = 10 dans Control et n = 8 dans RhoA cKO pour Fbn1. j Co-immunomarquage de l'aggrécane et de l'α-SMA dans l'aorte de la souris après le traitement. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI. Pointes de flèche : position de la rupture AAA (f, g, j). Barres d'échelle : 1 mm (d) et 100 μm (f, g, j). Dans (a), une ANOVA bidirectionnelle ou unidirectionnelle a été appliquée pour comparer les données entre les groupes et les semaines, respectivement, et dans (c, e, h, i), les données entre les deux groupes ont été analysées par test t . †p < 0,05, ††p < 0,01 et †††p < 0,001 par rapport à la semaine 0 ; *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport au contrôle.

Nous avons ensuite examiné le rôle de RhoA dans les CMLV dans la contractilité de l'aorte et des CMLV. Après perfusion de solution saline ou à la fois d'AngII et de BAPN pendant 4 semaines, la tension isométrique de l'aorte de souris isolée a été mesurée par un myographe à fil. Les aortes des souris témoins ont résisté à la tension la plus élevée générée par le myographe multifilaire à des niveaux similaires après l'infusion de solution saline et d'AngII + BAPN, tandis que les aortes des souris RhoA cKO étaient fragiles et ont conservé la tension aortique inférieure quel que soit le traitement avec une solution saline ou AngII + BAPN (Fig. 3a). Nous avons également effectué un test de contractilité sur gel de collagène in vitro en utilisant des CMLV isolées de l'aorte de souris contrôle et RhoA cKO. Nous avons constaté qu'indépendamment du traitement à l'AngII, la réduction du diamètre du gel de collagène contenant des CMLV RhoA cKO était significativement altérée, par rapport à celle du gel contenant des CMLV témoins (Fig. 3b, c). Ces résultats indiquent que les CMLV RhoA cKO ont moins de contractilité que les CMLV témoins.

a Modifications de la tension de l'anneau aortique mesurées par un myographe à fil. n = 6, chaque groupe. b Test de contractilité sur gel de collagène in vitro utilisant des CMLV aortiques de souris isolées par traitement avec une solution saline ou AngII. c Graphique récapitulatif du diamètre du gel de collagène contenant des VSMC examiné en (b). n = 7–10, chaque groupe. d Immunomarquage de l'α-SMA dans l'aorte de la souris après le traitement de 4 semaines. e Images d'immunofluorescence de CMLV aortiques colorées avec l'anticorps α-SMA après traitement avec une solution saline ou AngII pendant 24 h. La F-actine et les noyaux ont été visualisés avec de la phalloïdine et du DAPI, respectivement, en (d, e). f Western blot de α-SMA dans les CMLV aortiques après traitement avec une solution saline ou AngII pendant 24 h. GAPDH a été buvardé pour le contrôle de chargement. g Graphique récapitulatif du rapport α-SMA/GAPDH examiné en (f). n = 6, chaque groupe. h Analyse qPCR des gènes liés au phénotype contractile des CMLV. Les CMLV aortiques ont été traitées avec une solution saline ou AngII pendant 24 h. n = 8, chaque groupe. Barres d'échelle : 2 mm (b), 20 μm (d) et 50 μm (e). Une ANOVA bidirectionnelle (a, c) ou unidirectionnelle (g, h) a été appliquée pour comparer les données entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs contrôle dans le même traitement ; †††p < 0,001 vs Contrôle dans le traitement salin.

Ensuite, nous avons vérifié les aortes et les CMLV témoins et RhoA cKO en examinant les marqueurs de la structure contractile des CMLV, tels que α-SMA6. Les analyses d'immunofluorescence et de Western blot ont montré que l'expression de l'α-SMA était diminuée dans l'aorte RhoA cKO et les CMLV, par rapport aux témoins (Fig. 3d – g). De plus, une expression réduite et désorganisée de la F-actine a été observée en réponse à la perte de RhoA dans l'aorte et les CMLV (Fig. 3d, e). L'expression réduite de l'α-SMA et l'altération de la F-actine ont également été trouvées dans la zone AAA de l'aorte témoin (Fig. 3b supplémentaire). La qPCR a révélé une expression significativement réduite d'autres gènes marqueurs contractiles, Mylk et Myh11 ainsi que Acta2, dans les CMLV RhoA cKO par rapport aux CMLV témoins (Fig. 3h). Nous avons en outre effectué les expériences de sauvetage pour confirmer que les expressions réduites de l'α-SMA et d'autres gènes marqueurs contractiles des CMLV dépendaient spécifiquement de la perte de RhoA dans les CMLV. Lorsque la GFP-RhoA de type sauvage (WT) a été réexprimée dans les CMLV RhoA cKO au niveau des CMLV témoins, l'expression de la protéine α-SMA a été complètement récupérée et une organisation normale de la F-actine a été observée dans les cellules (Fig. 4a–c). De même, l'expression réduite des gènes marqueurs contractiles dans les CMLV RhoA cKO a été restaurée par la réexpression de GFP-RhoA-WT (Fig. 4d supplémentaire).

Étant donné que le dysfonctionnement et la désorganisation de la couche médiale de l'aorte affectent généralement la fonction de barrière endothéliale et vice versa22,23, nous avons examiné la morphologie de la couche endothéliale et avons constaté que la couche était principalement perturbée au site de l'AAA chez les souris RhoA cKO après AngII+. Traitement BAPN (Fig. 4a). Cette fonction de barrière endothéliale altérée dans l'aorte RhoA cKO a été confirmée par l'accumulation de colorant dans la paroi aortique. Lorsque le colorant Evans Blue a été injecté par voie intraveineuse chez les souris, l'accumulation de colorant a été significativement augmentée chez les souris RhoA cKO traitées avec AngII + BAPN (Fig. 4b, c). La perturbation peut permettre aux cellules inflammatoires de s'infiltrer dans la paroi aortique. La coloration par immunofluorescence a montré que dans l'infusion saline, l'infiltration de cellules inflammatoires déterminée par les marqueurs CD68 et F4/80 était minime dans les aortes témoins et RhoA cKO, mais en réponse au traitement avec AngII + BAPN, l'infiltration était nettement augmentée dans l'aorte RhoA cKO (Fig. 4d, e). Les cytokines inflammatoires facilitent la rupture de la couche endothéliale et l'infiltration des cellules inflammatoires24. Nous avons ensuite étudié l'expression des cytokines inflammatoires et constaté qu'elle était augmentée dans l'aorte RhoA cKO après une perfusion de réactifs de 4 semaines et dans les CMLV RhoA cKO isolées après stimulation par AngII (Fig. 4f, g). De plus, l'augmentation de l'expression des cytokines inflammatoires dans les CMLV RhoA cKO a été inversée par la transfection de GFP-RhoA-WT dans les cellules (Fig. 4e supplémentaire). Ces résultats suggèrent que la perte de RhoA dans les CMLV aortiques améliore l'inflammation vasculaire via la régulation à la hausse de la production de cytokines.

a Images d'immunofluorescence de l'aorte de souris contrôle et RhoA cKO colorées avec l'anticorps anti-CD31. L'aorte a été extraite après le traitement de 4 semaines avec une solution saline ou AngII + BAPN. La F-actine et les noyaux ont été visualisés avec de la phalloïdine et du DAPI, respectivement. Une flèche et une pointe de flèche indiquent respectivement la perte d'endothélium et l'infiltration de cellules inflammatoires. b Test de perméabilité vasculaire pour évaluer la fonction de barrière endothéliale dans l'aorte. 10 min après l'injection intraveineuse de colorant Evans Blue, l'aorte de souris traitées avec une solution saline ou AngII + BAPN a été extraite et l'accumulation de colorant a été mesurée. c Graphique récapitulatif de l'intensité moyenne de l'accumulation de colorant bleu Evans. n = 5, chaque groupe. d Images d'immunofluorescence de l'aorte de souris témoin et RhoA cKO colorées avec l'anticorps CD68 ou F4/80. L'aorte a été extraite comme décrit en (a). e Graphique récapitulatif du pourcentage de zone positive pour CD68 ou de zone positive pour F4/80 dans la média de l'aorte. n = 3–7, chaque groupe. f, g Graphiques des résultats de qPCR pour les cytokines inflammatoires dans l'aorte de souris (f) et les CMLV aortiques (g). L'aorte a été extraite comme décrit en (a) et les CMLV ont été traitées avec une solution saline ou AngII pendant 24 h. n = 3–6, chaque groupe. Barres d'échelle : 30 μm (a, d) et 1 mm (b). Dans (c, e, f, g), une ANOVA unidirectionnelle a été appliquée pour comparer les données entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs contrôle dans le même traitement. †p < 0,05, ††p < 0,01 et †††p < 0,001 vs RhoA cKO dans le traitement salin.

Pour étudier plus avant les mécanismes potentiels de la destruction accrue de l'élastine dans l'aorte RhoA cKO, nous avons examiné les expressions de MMP2 et MMP9, qui sont des protéinases clés dans la destruction des protéines de la matrice extracellulaire (ECM). Le niveau d'ARNm de Mmp2 dans les CMLV cultivées stimulées par l'AngII était significativement plus élevé dans le RhoA cKO que dans le témoin (Fig. 5a supplémentaire). L'immunomarquage a montré que l'expression de MMP2 dans l'aorte était augmentée chez les souris RhoA cKO, par rapport aux souris témoins, après traitement avec AngII et BAPN (Fig. 5b, c supplémentaires). Des résultats similaires ont été obtenus pour l'expression de MMP9 (Fig. 5a, d, e supplémentaires). En revanche, les expressions de l'inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase 1 (TIMP1) et du TIMP2, qui sont des inhibiteurs endogènes des MMP, ont été nettement réduites dans les CMLV cultivées et l'aorte de souris RhoA cKO (Fig. 5f – j supplémentaires), ce qui suggère que les deux MMP ont augmenté. l'expression et leur activité accrue à partir de l'expression réduite des TIMP contribuent de manière coopérative à la dégradation robuste de l'ECM pour la formation d'AAA dans l'aorte des souris RhoA cKO. La zymographie utilisant des échantillons de tissu aortique humain a également détecté des quantités plus élevées de MMP2 et MMP9 pro et matures dans la lésion AAA que dans la zone normale (Fig. 5k, l supplémentaires). Ces données indiquent que RhoA inhibe l'expression et l'activation des MMP, entraînant moins d'anomalies de la MEC dans l'aorte des souris témoins après stimulation pharmacologique.

Nous avons ensuite cherché à étudier la voie de signalisation responsable de l'inflammation et de l'expression des MMP dans les CMLV de l'aorte. Des études antérieures ont montré que les facteurs de signalisation de la protéine activée par les mitogènes (MAP) kinase, tels que la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) et p38, régulent les phénomènes ci-dessus25,26. Ainsi, nous avons examiné l'activité (niveau de phosphorylation) de ERK1/2 et p38. Le signal d'immunofluorescence de ERK1 / 2 et p38 phosphorylés a été augmenté dans l'aorte RhoA cKO, par rapport à l'aorte témoin, après le traitement AngII + BAPN de 4 semaines (Fig. 5a – d). Cette augmentation a également été observée dans les CMLV stimulées avec AngII (Fig. 5e, f). Pour explorer davantage la molécule qui régule l'activité des MAP kinases, nous nous sommes concentrés sur MAP4K427,28, qui est également liée à l'inflammation vasculaire et à la contractilité des cardiomyocytes29,30. L'activation induite par la stimulation pharmacologique (phosphorylation) de MAP4K4 était significativement plus élevée dans l'aorte et les CMLV isolées des souris RhoA cKO que chez celles des souris témoins (Fig. 5g – j). De plus, l'amélioration induite par AngII de la voie de signalisation de la MAP kinase dans les CMLV RhoA cKO a été ramenée au niveau des CMLV témoins par réexpression de GFP-RhoA-WT (Fig. 4f, g supplémentaires). La spécificité des anticorps pour l'immunomarquage phosphorylé de ERK1/2, p38 et MAP4K4 a été validée par des expériences utilisant les aortes RhoA cKO après administration d'inhibiteurs. Les signaux pour ERK1 / 2, p38 et MAP4K4 phosphorylés, clairement détectés par le traitement AngII + BAPN, ont disparu en présence de l'inhibiteur de chaque molécule de signalisation de la MAP kinase (Fig. 6 supplémentaire). Dans l'aorte humaine, l'activation de MAP4K4 a été renforcée dans la lésion AAA, par rapport à la zone normale (Fig. 5k – n), et même chez les souris témoins, l'activation renforcée a également été observée au site de l'AAA (Fig. Supplémentaire 3d , e). Ces résultats suggèrent que RhoA dans les CMLV peut atténuer la cascade de signalisation de la MAP kinase pour empêcher la formation d'AAA.

a, c, g, k Images d'immunofluorescence de l'aorte de souris contrôle et RhoA cKO après le traitement de 4 semaines avec AngII + BAPN (a, c, g) et des zones normales et AAA de l'aorte humaine (k). La F-actine et les noyaux ont été visualisés avec de la phalloïdine et du DAPI, respectivement. b, d, h, l Graphique récapitulatif du pourcentage de surface positive pour chaque molécule de signalisation de MAP kinase. n = 9 dans le contrôle et n = 10 dans RhoA cKO (b), n = 8 dans le contrôle et n = 10 dans RhoA cKO (d), et n = 5, chaque groupe (h, l). e, i Western blot avec les anticorps indiqués en utilisant des CMLV aortiques cultivées après traitement avec une solution saline ou AngII pendant 24 h. GAPDH a servi de contrôle de chargement. f, j Graphique récapitulatif du rapport des molécules de signalisation de la MAP kinase phosphorylée/totale dans chaque groupe. n = 3–5, chaque groupe. m Western blot pour P-MAP4K4 et MAP4K4 total dans les zones normales et AAA de l'aorte humaine. n Graphique récapitulatif du rapport P-MAP4K4/MAP4K4. n = 4, chaque groupe. Barres d'échelle : 20 μm (a, c, g, k). Dans (b, d, h, l, n), les données entre les deux groupes ont été analysées par test t, et dans (f, j), une ANOVA unidirectionnelle a été appliquée pour comparer les données entre les groupes. *p < 0,05 et ***p < 0,001 vs Contrôle ou Normal ; †p < 0,05 et †††p < 0,001 vs RhoA cKO dans le traitement salin.

Nous avons en outre évalué l'importance de l'activité de MAP4K4 pour la formation d'AAA en l'absence de CMLV RhoA à l'aide de l'inhibiteur de MAP4K4 DMX-5804. La formation d'AAA a été significativement réduite par un traitement intraveineux avec du DMX-5804 en plus de l'AngII et du BAPN chez les souris RhoA cKO, sans modification de l'hémodynamique (tableau 2, figure 6a et figure supplémentaire 7a). Les analyses histologiques ont montré que le traitement au DMX-5804 inversait la morphologie défavorable et la dégradation de l'aorte RhoA cKO similaire à l'aorte témoin traitée au DMX-5804 (Fig. 6b – d). Il a également été confirmé que le traitement au DMX-5804 n'affectait pas les fonctions cardiaques et les volumes plasmatiques chez les souris RhoA cKO ainsi que chez les souris témoins (Fig. 7b, c supplémentaires). Nous avons en outre découvert que la tension aortique des souris RhoA cKO était récupérée par inhibition de MAP4K4 avec DMX-5804 (Fig. 6e). Le test de contractilité sur gel de collagène utilisant des CMLV isolées a également montré des résultats similaires (Fig. 6f), et des anomalies morphologiques avec une expression réduite de l'α-SMA et une organisation perturbée de la F-actine dans les CMLV traitées avec AngII ont été inversées par le DMX-5804 (Fig. 6g).

a Aspect externe de l'aorte avec le cœur et les reins extraits après le traitement de 4 semaines avec AngII et BAPN en présence de 0,5 % de DMSO (véhicule) ou de DMX-5804 (DMX). Une flèche indique un AAA formé. b Coloration HE de l'aorte. c Coloration Verhoeff Van Gieson de l'aorte. d Graphique récapitulatif du degré de dégradation de l'élastine analysé en (c). n = 7–11, chaque groupe. e Modifications de la tension de l'anneau aortique mesurées par myographe à fil. n = 10 en AngII+BAPN + Véhicule et n = 6 en AngII+BAPN + DMX. f Modifications du diamètre du gel de collagène contenant des CMLV aortiques dans un test de contractilité sur gel de collagène in vitro. n = 10 en AngII+Véhicule et n = 8 en AngII+DMX. g Images d'immunofluorescence de CMLV aortiques colorées avec l'anticorps α-SMA après traitement avec AngII en présence de véhicule ou de DMX-5804 pendant 24 h. La F-actine et les noyaux ont été visualisés avec de la phalloïdine et du DAPI, respectivement. h, j Western blot avec les anticorps indiqués en utilisant des CMLV aortiques après traitement avec ou sans AngII ou DMX-5804 pendant 24 h. GAPDH a servi de contrôle de chargement. i, k Graphiques récapitulatifs des rapports P-MLC2/MLC2, P-MYLK/MYLK et MYLK/GAPDH. n = 4 (i), n = 3–4 (k), chaque groupe. l Expériences d'immunoprécipitation utilisant les anticorps indiqués. L'IgG a été utilisé comme contrôle négatif pour l'immunoprécipitation. m Analyse qPCR à l'aide de CMLV traitées avec ou sans AngII et/ou DMX-5804 pendant 24 h. n = 4–5, chaque groupe. Barres d'échelle : 500 μm (b, c) et 20 μm (g). Une ANOVA unidirectionnelle (d, i, k, m) ou bidirectionnelle (e, f) a été appliquée pour comparer les données entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs véhicule ou témoin ; ††p < 0,01 et †††p < 0,001 vs traitement AngII sans DMX-5804 ; §p < 0,05 vs aucun traitement.

Étant donné que la contractilité des CMLV dépend de manière critique du niveau de phosphorylation de la chaîne légère de myosine 2 (MLC2), nous avons donc examiné le niveau dans les CMLV par western blot. Après stimulation par AngII, la MLC2 phosphorylée a augmenté dans les CMLV témoins, mais aucune augmentation n'a été détectée dans les CMLV RhoA cKO ; le traitement des CMLV RhoA cKO avec DMX-5804 a restauré le niveau de phosphorylation de MLC2 similaire à celui des CMLV témoins (Fig. 6h, i). La phosphorylation de MLC2 est régulée par l'équilibre de la fonction de deux enzymes : la myosine light chain kinase (MYLK), qui induit la phosphorylation de MLC2, et la myosin light chain phosphatase (MLCP), qui déphosphoryle MLC2 et est fortement inhibée par ROCK31,32 . Dans les CMLV RhoA cKO, l'expression de MYLK a été réduite, ce qui était conforme aux résultats de l'ARNm de la Fig. 3h, et la MYLK phosphorylée (la forme inactivée de MYLK) a augmenté même avec l'expression réduite de MYLK (Fig. 6j, k). La phosphorylation accrue de MYLK par perte de RhoA a été bloquée par un traitement avec DMX-5804. De plus, des tests d'immunoprécipitation ont montré que MAP4K4 interagissait avec MYLK (Fig. 6l). Ces résultats suggèrent que MAP4K4 phosphoryle et inactive MYLK, conduisant à l'inhibition de la phosphorylation de MLC2. De plus, nous avons observé que l'expression réduite de Myh11 ainsi que d'Acta2 dans les CMLV RhoA cKO était récupérée par un traitement au DMX-5804 (Fig. 6m). Ensemble, ces données indiquent l'implication de MAP4K4 dans la régulation de la contractilité des CMLV.

L'effet inhibiteur du DMX-5804 sur l'inflammation et la signalisation de la MAP kinase a été examiné dans les échantillons aortiques de souris et les CMLV. Un traitement supplémentaire avec DMX-5804 a considérablement réduit les niveaux d'expression de F4 / 80 et de MMP2 ainsi que la phosphorylation de MAP4K4 dans l'aorte de souris RhoA cKO (Fig. 8a, b supplémentaires). L'analyse par Western blot a montré que l'inhibition de MAP4K4 avec DMX-5804 dans les CMLV diminuait l'activation induite par AngII de la signalisation p38 et ERK1 / 2 associée à l'inflammation vasculaire et à la dégradation de l'ECM (Fig. 8c, d supplémentaires). En effet, l'augmentation de l'expression des cytokines inflammatoires dans les CMLV RhoA cKO après le traitement par AngII a été significativement supprimée par le DMX-5804 (Fig. 8e supplémentaire), et les modifications induites par l'AngII de l'expression des MMP et des TIMP dans les CMLV RhoA cKO ont été complètement annulées par le DMX-5804. (Fig. 8f supplémentaire). Ensemble, ces résultats indiquent que l'inhibition de MAP4K4 dans les CMLV dépourvues de RhoA supprime la formation d'AAA, sauve la contractilité des CMLV et atténue l'inflammation vasculaire et la dégradation de l'ECM par l'inactivation de la signalisation de la MAP kinase.

Pour explorer le mécanisme moléculaire par lequel RhoA module l'activité de MAP4K4 dans les CMLV, nous avons effectué une immunoprécipitation et une spectrométrie de masse (MS). Les CMLV RhoA cKO transfectées avec le vecteur de contrôle GFP-RhoA-wild-type (WT) ou GFP ont été stimulées avec AngII, puis les lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-GFP, suivi de la détection d'immunoprécipitants dans Coomassie Brilliant Blue (CBB ) coloration (Fig. 7a). Les protéines co-immunoprécipitées avec GFP-RhoA-WT, mais pas GFP, ont été analysées par chromatographie liquide (LC)-MS/MS. L'analyse a identifié 1453 peptides appartenant à 359 protéines (Données supplémentaires 1). Récemment, il a été rapporté que l'activité de MAP4K4 était régulée par le complexe phosphatase et kinase interagissant avec la striatine (STRIPAK), qui se trouve en aval de RhoA33,34. Sur la base de ce rapport, nous avons effectué une analyse in silico des 359 protéines afin d'identifier la protéine pouvant interagir préférentiellement avec un composant du complexe STRIPAK. Nous avons constaté que Set (n° d'accession Q9EQU5) avait le score le plus élevé pour la liaison à la protéine phosphatase 2A (PP2A), un composant STRIPAK qui régule négativement l'activité de MAP4K4 en réduisant la phosphorylation de MAP4K4. Des études antérieures ont également montré que Set s'associe à PP2A et inhibe son activité phosphatase35,36, et qu'il régule la signalisation de Rac1, une autre GTPase de la famille Rho37.

a Après transfection du plasmide d'expression GFP ou GFP-RhoA-WT, les CMLV ont été stimulées avec AngII pendant 24 h. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités et immunotransférés avec l'anticorps anti-GFP (panneau supérieur), et les protéines immunoprécipitées contre l'anticorps anti-GFP ont été détectées par coloration au bleu brillant de Coomassie (CBB) (panneau inférieur). Étoile simple et étoiles doubles : chaînes lourdes et légères d'IgG, respectivement. Flèches : GFP transfectée ou GFP-RhoA-WT. Les bandes entourées de rectangles en pointillés rouges ont été analysées plus en détail par LC-MS/MS. b Western blot pour P-MAP4K4 et MAP4K4 dans des CMLV RhoA cKO aortiques transfectées avec des ARNsi brouillés ou siSet. c Graphique récapitulatif du rapport P-MAP4K4/MAP4K4. d Des extraits cellulaires de CMLV témoins après traitement salin ou AngII ont été utilisés dans des tests pull-down avec la protéine de fusion GST, y compris le domaine de liaison RhoA lié au GTP de mDia, suivi d'un transfert Western avec un anticorps anti-Set ou anti-RhoA. e Après stimulation des CMLV témoins ou RhoA cKO avec AngII pendant 24 h, les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-PP2A ou une IgG témoin, suivis d'un transfert Western avec les anticorps indiqués. f Images d'immunofluorescence de CMLV témoins ou RhoA cKO colorées avec les anticorps indiqués après traitement avec AngII pendant 24 h. Les noyaux ont été visualisés avec DAPI. Barres d'échelle : 20 μm. g, j Après transfection de cellules avec stimulation par ARNsi scramble ou siSet et AngII pendant 24 h, des extraits cellulaires de CMLV contrôle ou RhoA cKO ont été immunotransférés avec les anticorps indiqués. h, k Graphiques récapitulatifs des rapports de molécules de signalisation de MAP kinase phosphorylée/totale (h) et des rapports P-MLC2/MLC2, P-MYLK/MYLK et MYLK/GAPDH (k). n = 3 (h) et n = 4–5 (k), chaque groupe. i Graphique récapitulatif de l'essai in vitro de contractilité sur gel de collagène contenant des CMLV utilisant des CMLV RhoA cKO stimulées par AngII transfectées avec des ARNsi brouillés ou siSet. n = 8, chaque groupe. Les données ont été analysées par test t (c), ANOVA unidirectionnelle (h, k) ou ANOVA bidirectionnelle (i) pour comparer les groupes. Dans (c), ***p < 0,001 vs Scramble ; dans (h, k), **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs Contrôle, ††p < 0,01 et †††p < 0,001 vs Scramble ; dans (i), *p < 0,05 vs Scramble.

Ensuite, pour déterminer si Set contribue réellement à la régulation de l'activité de MAP4K4, nous avons effectué des expériences d'inactivation dans des CMLV RhoA cKO avec stimulation par AngII, et avons constaté que la transfection d'ARNsi Set réduisait de manière significative la phosphorylation de MAP4K4 (Fig. 7b, c). Ensuite, nous avons émis l'hypothèse qu'en réponse à la stimulation de l'AngII dans les CMLV, l'interaction de Set avec la RhoA activée induite par l'AngII serait augmentée, ce qui dissocie Set de PP2A, et que la PP2A libre pourrait se lier à MAP4K4 et inhiber l'activation de MAP4K4. Conformément à cette hypothèse, l'interaction de Set avec RhoA liée au GTP a été augmentée dans les CMLV après stimulation par AngII (Fig. 7d). Dans les CMLV témoins stimulées avec AngII, l'association de PP2A à MAP4K4 a été observée, et cette association a été altérée par la perte de RhoA en raison de la liaison PP2A-Set (Fig. 7e panneaux de gauche et Fig. 7f), ce qui conduit à l'autophosphorylation de MAP4K438. De plus, lorsque Set a été renversé dans les CMLV RhoA cKO, l'association entre PP2A et MAP4K4 a été restaurée (Fig. 7e panneaux de droite). En revanche, lorsque les CMLV témoins ont été transfectées avec l'isoforme 1 et l'isoforme 2 étiquetées HA (HA-Set1 et HA-Set2) et stimulées avec AngII, la liaison PP2A-Set a été augmentée et l'association PP2A-MAP4K4 a diminué même en présence de RhoA (Fig. 9a supplémentaire), suggérant l'interaction moléculaire équilibrée et fonctionnelle entre Set, PP2A et MAP4K4 en aval de RhoA.

Enfin, nous avons confirmé que la régulation médiée par Set de l'activation de MAP4K4 était impliquée dans l'activation des kinases MAP et la contractilité des CMLV en aval de MAP4K4. Sous la stimulation AngII, la phosphorylation de ERK1 / 2 et p38 ainsi que de MAP4K4 n'a pas été augmentée dans les CMLV RhoA cKO par un renversement supplémentaire de Set (Fig. 7g, h). De manière constante, la contractilité des CMLV a été préservée, la phosphorylation de MLC2 a été restaurée et la phosphorylation de MYLK n'a pas augmenté dans les CMLV RhoA cKO avec transfection siSet (Fig. 7i – k). Dans les CMLV témoins stimulées par AngII transfectées avec HA-Set1 et HA-Set2, MAP4K4, ERK1 / 2 et p38 phosphorylés ont été significativement augmentés, par rapport aux CMLV transfectées avec un plasmide vide (Fig. 9b, c supplémentaires). De plus, la surexpression de HA-Set1 et HA-Set2 a supprimé la phosphorylation de MLC2 et facilité l'inactivation (phosphorylation) de MYLK (Fig. 9d, e supplémentaire), qui peut résulter de l'activation accrue de MAP4K4 par l'abondant Set- dissociation médiée de MAP4K4 de PP2A. Collectivement, ces résultats suggèrent que RhoA régule négativement l'activation de MAP4K4 via Set et PP2A, entraînant le maintien de la contractilité et de la morphologie des CMLV et de l'aorte.

Dans cette étude, nous avons identifié les effets protecteurs de RhoA dans les CMLV sur la formation d'AAA à l'aide de tissus aortiques humains, d'un modèle de souris RhoA cKO et d'approches in vitro. La perte de RhoA est impliquée à la fois dans le dysfonctionnement de la contractilité des CMLV et dans l'amélioration de l'inflammation vasculaire. Ces conclusions sont basées sur les résultats suivants : (1) l'expression de RhoA a été remarquablement réduite dans les lésions AAA humaines, (2) la formation d'AAA a été augmentée chez les souris RhoA cKO traitées avec AngII et BAPN, (3) l'expression des gènes liés à la contractilité des VSMC a été réduite par la perte de RhoA, et la diminution de la contractilité des CMLV avec l'expression de cytokines inflammatoires a été induite, (4) l'infiltration des cellules inflammatoires et le dysfonctionnement endothélial ont été améliorés dans l'aorte de souris RhoA cKO, (5) l'épuisement de RhoA a induit la dégradation de l'ECM, comme déterminé par l'augmentation de l'activité des MMP et la diminution L'activité des TIMP et (6) la cascade de kinases MAP médiées par MAP4K4 ont été activées dans l'aorte RhoA-null et les CMLV.

Bien que plusieurs rapports aient montré l'implication des régulateurs de RhoA, tels que GAP ou GDP dissociation stimulator pour RhoA, dans l'anévrisme de l'aorte thoracique dont les caractéristiques sont différentes de l'AAA39,40, la RhoA elle-même n'a pas été certifiée comme molécule prédisposante à la prévention de l'AAA, qui se dévoile dans cette étude. Nous avons également constaté que RhoA dans les CMLV était important pour l'expression des gènes de génération de force, tels que Acta2 et Myh11, et la suppression de la transcription des gènes des cytokines/chimiokines, telles que Il1b et Ccl2. Ainsi, la déplétion de RhoA dans les CMLV a favorisé l'expression de ces cytokines/chimiokines et recrute des cellules inflammatoires dans la média de l'aorte, en plus de la contractilité réduite des CMLV. Les cellules inflammatoires accumulées dans la paroi aortique produisent également des MMP abondantes et améliorent leur activation, conduisant à la vulnérabilité de la paroi41. Ces phénomènes peuvent contribuer de manière critique à l'induction d'AAA.

MAP4K4 dans les cellules endothéliales favorise l'inflammation vasculaire30. MAP4K4 agit comme un régulateur en amont de la voie de signalisation de la MAP kinase, et l'épuisement de MAP4K4 supprime la voie et l'inflammation27,42. Dans cette étude, nous avons identifié l'association entre RhoA et MAP4K4 dans les CMLV et constaté que cette association est importante pour la prévention des AAA. En présence de RhoA, les activités des kinases MAP4K4 et MAP ont été inhibées, même après stimulation par AngII, entraînant la réduction de l'inflammation. En revanche, en l'absence de RhoA dans les CMLV, l'activité de MAP4K4 était régulée positivement et l'incidence de la formation d'AAA était significativement augmentée. Lorsque l'activité de MAP4K4 a été atténuée par DMX-5804 chez des souris RhoA cKO et des CMLV appauvries en RhoA, non seulement la réponse inflammatoire médiée par MAP4K4, mais également la contractilité vasculaire ont été clairement récupérées en induisant l'activité MYLK et MLC2 ainsi que l'expression d'Acta2 et Myh11. De plus, la formation d'AAA induite par la perte de RhoA a été complètement inhibée par le traitement au DMX-5804. Cela montre que RhoA transduit le signal vers MAP4K4 pour inhiber son activité, et que l'inhibition a un effet protecteur sur la formation d'AAA, suggérant que MAP4K4 pourrait représenter une cible thérapeutique contre les AAA.

Une autre découverte de notre étude est l'identification d'une molécule de signalisation qui relie RhoA et STRIPAK, un complexe moléculaire qui module l'activité de MAP4K4. Une étude précédente a montré que la RhoA active liée au GTP supprimait l'activation (phosphorylation) de MAP4K4 via PP2A, une phosphatase du complexe STRIPAK34. Cependant, la façon dont RhoA régule la fonction PP2A est inconnue. Nous avons effectué un test pull-down et une LC-MS/MS en utilisant des CMLV stimulées par AngII pour identifier la ou les molécules qui s'associent à la fois à RhoA et à PP2A. Par l'analyse in silico postérieure à la LC-MS/MS, Set s'est avéré être un candidat à l'association. Nous avons en outre confirmé l'association moléculaire par immunoprécipitation et découvert que la RhoA activée se liait préférentiellement à Set, ce qui dissociait Set de PP2A. Parce que Set est un suppresseur de PP2A35,36, la dissociation de Set de PP2A induit l'activation de PP2A et l'inhibition ultérieure de MAP4K4. À l'inverse, l'inactivation de Set in RhoA cKO CMLV a annulé l'augmentation de la phosphorylation de MAP4K4 et de ses MAP kinases en aval, et a restauré la contractilité des CMLV en présence d'un traitement à l'AngII. Ces résultats indiquent que Set pourrait représenter une autre cible thérapeutique contre les AAA. En conclusion, nos résultats de cette étude sont schématiquement résumés dans la Fig. 10 supplémentaire.

Bien que la recherche sur l'AAA continue d'augmenter, les traitements de cette maladie vasculaire dévastatrice sont encore limités43,44. L'AAA est une maladie vasculaire progressive potentiellement mortelle qui se développe silencieusement et provoque souvent une mort subite par rupture aortique. Ainsi, un diagnostic précoce et la découverte de nouveaux traitements sont nécessaires pour inhiber le développement de la formation d'AAA. Des études antérieures ont montré que les troubles génétiques dans les CMLV jouent un rôle crucial dans AAA2. À cet égard, la présente étude ajoute à la compréhension actuelle de la pathologie AAA, montrant que RhoA régule les protéines de génération de force pour maintenir la contractilité aortique et inhibe l'inflammation vasculaire, médiée par MAP4K4. Bien que d'autres études soient nécessaires, nous supposons que RhoA pourrait être un biomarqueur diagnostique de l'AAA et que le maintien de son expression dans les CMLV de l'aorte est important pour contrecarrer la formation d'AAA et le pronostic de cette maladie.

L'une des limites de cette étude pourrait être que la formation d'AAA a été induite par la stimulation pharmacologique de l'AngII et du BAPN chez les souris RhoA cKO, tandis que l'AAA humain est généralement formé par le résultat de l'hypertension et de la paroi aortique médiées par le vieillissement et/ou l'athérosclérose. vulnérabilité45,46. Dans l'état basal, nous n'avons pas pu trouver de différences entre les souris témoins et les souris RhoA cKO. Il pourrait y avoir une possibilité qu'une expression accrue d'autres membres de la famille Rho, tels que RhoB, compense la perte de RhoA dans la couche médiale de l'aorte pour maintenir la structure aortique normale. Étant donné que l'administration d'AngII et de BAPN est souvent utilisée pour générer le modèle animal AAA47,48, l'utilisation de ces réactifs pourrait être acceptable pour l'étude de la fonction de la molécule cible, telle que RhoA, dans le processus et le mécanisme de formation d'AAA. Il pourrait être intéressant d'examiner plus avant si la formation d'AAA est accélérée par le vieillissement chez les souris RhoA cKO. Parce que cela prend trop de temps et sort du cadre de cette étude, ce serait un futur plan de recherche expérimentale.

En conclusion, nous avons réussi à montrer que les VSMC RhoA contrecarraient la formation d'AAA dans le modèle de souris cKO et ont révélé le mécanisme par lequel RhoA supprimait l'activité de MAP4K4 par Set pour prévenir les AAA. En ce qui concerne les implications translationnelles et cliniques, un inhibiteur de MAP4K4 DMX-5804 a inversé les phénomènes indésirables de formation d'AAA induits par la perte de RhoA dans les CMLV, offrant un potentiel thérapeutique de cet inhibiteur d'AAA dans lequel l'expression de RhoA et l'activité de MAP4K4 étaient remarquablement diminuées. Il s'agit d'une découverte précieuse car il n'existe actuellement aucun traitement pharmaceutique efficace pour les AAA.

Tous les protocoles utilisant des échantillons d'aorte humaine ont été approuvés par le Comité d'éthique de la recherche de l'Université des sciences médicales de Shiga et sont conformes aux principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Des tissus aortiques ont été prélevés sur des patients atteints d'AAA après chirurgie. Les caractéristiques cliniques des patients ont été résumées dans le tableau supplémentaire 1. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit pour l'utilisation de tissus aortiques pour cette étude.

Nous avons généré des souris RhoA-floxées par recombinaison homologue de l'allèle RhoA dans des cellules souches embryonnaires (ES). Le vecteur cible contenait l'exon 3 du gène RhoA flanqué de sites loxP et du gène neo. Les cellules ES ont été transfectées avec le vecteur et sélectionnées par traitement avec G418. Le gène neo a été éliminé par administration transitoire de recombinase Cre. Des cellules ES hébergeant l'allèle RhoA-floxé sans neo ont été microinjectées dans des blastocystes pour générer des souris chimériques. Les souris chimériques ont ensuite été croisées avec des souris B6D2F1 (CLEA Japon, Tokyo, Japon) pour obtenir des souris hétérozygotes pour l'allèle RhoA-floxé. Les souris hétérozygotes ont été rétrocroisées au moins six fois avec la souche C57BL/6, et des souris hétérozygotes mâles et femelles ont été croisées pour obtenir des souris homozygotes pour l'allèle RhoA-floxé. Ensuite, les souris homozygotes ont été accouplées avec des souris transgéniques exprimant la recombinase Cre pilotée par le promoteur SM22α (SM22α-Cre) sur la souche C57BL / 6, qui ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). La progéniture avec à la fois l'allèle hétérozygote RhoA-floxé et le gène Cre a de nouveau été accouplée avec les souris homozygotes RhoA-floxées pour générer des souris RhoA cKO spécifiques aux CMLV. Des souris de même portée sans le gène Cre ont été utilisées comme contrôle. Au total, 106 souris (souris mâles âgées de 10 à 14 semaines. Contrôle n = 47 ; RhoA cKO n = 59) ont été utilisées dans cette étude. Les amorces de génotypage pour détecter les souris avec l'allèle floxé Cre et RhoA étaient les suivantes : Cre, Forward 5′-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3′ et Reverse 5′-AGTTACCCCCAGGCTAAGTGC-3′ ; RhoA-floxé, avant 5′-TCTTAACCGCTGAGGCCATCT-3′ et inverse 5′-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3′.

Pour induire un AAA chez la souris, AngII (1000 ng/kg/min) et BAPN (37,5 mg/kg/j) ont été administrés pendant 4 semaines à l'aide de mini-pompes osmotiques (ALZET modèle 1004 ; Durect Corp., Cupertino, CA, USA) comme décrit précédemment avec quelques modifications49. Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (1,0 à 1,5 %). Deux mini-pompes remplies d'AngII et de BAPN dissous dans une solution saline stérile, respectivement, ont été implantées dans l'espace sous-cutané à travers une petite incision à l'arrière du cou. Des pompes remplies uniquement de solution saline ont été utilisées comme contrôle. Les sites d'incision ont été fermés par suture et ont cicatrisé rapidement sans aucune infection. Chez certaines souris, l'inhibiteur de MAP4K4 DMX-5804 (2,5 mg/kg) dissous dans 0,5 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) a été administré par voie intraveineuse par la veine caudale trois fois par semaine pendant 4 semaines. Les diamètres aortiques et la contractilité et les dimensions cardiaques ont été surveillés sous anesthésie à l'isoflurane (1,0 à 1,5 %) par échographie (Vevo 2100 ; VisualSonics Inc., Toronto, Canada). Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université des sciences médicales de Shiga et ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes, y compris les directives ARRIVE (Animal Research Reporting of In Vivo Experiments).

La pression artérielle artérielle a été mesurée chaque semaine chez des souris conscientes en utilisant la méthode pléthysmographique du brassard de queue (modèle BP-98-AL ; Softron, Tokyo, Japon). Les souris ont été réchauffées pendant au moins 5 à 10 min à 37 ° C dans le thermostat cylindrique avant et pendant la mesure de la pression artérielle. La TA a été mesurée à des intervalles de 2 minutes et la moyenne de sept mesures à l'état d'équilibre a été utilisée comme TA chez chaque souris50.

Les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale et l'aorte a été perfusée séquentiellement avec une solution saline tamponnée au phosphate froide (PBS) et du formol tamponné au phosphate à 10% à la pression physiologique pendant 5 minutes à chaque fois. Les échantillons extraits d'aorte de souris et humaine ont été fixés avec du formol tamponné au phosphate à 10 % pendant 24 h et inclus dans de la paraffine. Des coupes transversales (4 µm d'épaisseur) ont été préparées et déparaffinées. La coloration HE a été réalisée pour détecter la morphologie des aortes. Pour la coloration de Verhoeff Van Gieson, les coupes fixées au formol et déparaffinées ont été incubées avec la solution de Verhoeff pendant 1 h, contre-colorées avec la solution de Van Gieson, rapidement déshydratées et montées sur la lame de verre. La dégradation de la lame élastique médiale a été analysée par gradation de dégradation (pas de dégradation, dégradation légère, dégradation sévère et rupture aortique)51.

Des informations détaillées sur les anticorps primaires utilisés dans cette étude ont été résumées dans le tableau supplémentaire 2.

Des échantillons d'aorte humaine fixés au formol et inclus en paraffine ont été sectionnés et déparaffinés. Les échantillons ont été trempés dans une solution de récupération d'antigène préchauffée (1 mmol/L d'acide citrique, 0,05 % de Tween 20 à pH 6) à 90–100 °C pendant 20–30 min, et refroidis à température ambiante. L'activité de la peroxydase endogène dans toutes les sections a été désactivée à l'aide de peroxydase d'hydrogène à 3 %, puis les échantillons ont été bloqués avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 3 % avant une incubation d'une nuit avec un anticorps anti-RhoA. Après lavage avec du PBS, les échantillons ont été incubés avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine (dilution 1:200; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pendant 1 h à température ambiante, suivi d'une incubation avec de la streptavidine-peroxydase (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon) pendant 30 min. Le complexe avidine-biotine a été détecté avec le kit de peroxydase Strep ABC (Nacalai Tesque). Les échantillons ont été contre-colorés avec de l'hématoxyline, suivis d'étapes de déshydratation.

Des cryosections d'échantillons d'aorte humaine et de souris et des échantillons de cœur de souris adulte ont été fixés avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 10 min, puis lavés trois fois avec du PBS pendant 5 min à chaque fois. Les échantillons ont été perméabilisés avec 0, 2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min et bloqués avec 3 à 5% de BSA pendant 30 min à température ambiante pour éviter une coloration non spécifique, suivis d'une incubation avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. L'anticorps secondaire marqué par un colorant fluorescent (Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 555, dilution 1:200-1000, Thermo Fisher Scientific), la phalloïdine rhodamine (dilution 1:600, Thermo Fisher Scientific) et la phalloïdine Alexa Fluor 488/647 (1 :dilution 600, Thermo Fisher Scientific) ont été appliqués pendant 1 h à température ambiante. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois, puis incubés avec une solution de montage avec du DAPI pour la coloration des noyaux (Dojindo, Kumamoto, Japon). Les images d'immunofluorescence ont été prises par un microscope confocal (FV-1000; Olympus, Tokyo, Japon, ou Leica SP8; Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne).

Pour la coloration des embryons de souris, les embryons à E11.5 ont été fixés avec du méthanol à 100 % pendant une nuit à 4 °C. Les cœurs ont été extraits et lavés avec du méthanol à 50 % dans du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 (PBST) pendant 30 min à 4 °C, puis lavés avec du PBST pendant 30 min à 4 °C. Les échantillons ont été bloqués avec du lait à 1% dans du PBST pendant 20 min à 4 ° C et ont été incubés avec les anticorps primaires pour RhoA et la chaîne lourde de l'α-myosine (α-MHC) pendant 48 h à 4 ° C. Ensuite, ils ont été lavés trois fois avec du PBST et ont été incubés avec les anticorps secondaires marqués par un colorant fluorescent pendant 48 h à 4 ° C. Enfin, ils ont été lavés trois fois avec du PBST et incubés avec une solution d'alcool benzylique:benzoate de benzyle (2: 3) pour une clarification optique. Les images d'immunofluorescence ont été prises au microscope confocal Leica SP8.

Pour valider la spécificité des anticorps utilisés pour l'immunomarquage des molécules de signalisation MAP kinase phosphorylées (activées), les inhibiteurs suivants ont été administrés à des souris RhoA cKO après le traitement de 4 semaines avec AngII et BAPN : PD-98059 pour l'inhibiteur ERK, SB-203580 pour l'inhibiteur de p38 et DMX-5804 pour l'inhibiteur de MAP4K4. Chaque inhibiteur a été dissous dans du DMSO à 0,5 % et 100 µL de la solution d'inhibiteur (PD-98059 : 10 mg/kg, SB-203580 : 5 mg/kg et DMX-5804 : 2,5 mg/kg) ont été injectés par voie intraveineuse par le veine caudale de souris RhoA cKO. Le solvant de 0,5 % de DMSO a été injecté par voie intraveineuse à d'autres souris comme véhicule. 30 min après l'injection, l'aorte a été récoltée et les coupes congelées ont été préparées pour l'immunocoloration.

L'ARN total a été isolé à partir d'aortes humaines et de souris et de CMLV de souris à l'aide du réactif d'isolement d'ARN TRIzol (Thermo Fisher Scientific). L'ADNc a été synthétisé par le ReverTra Ace qPCR RT Master Mix avec gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japon). Après transcription inverse, une PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide de l'instrument LightCycler (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse). Les données de PCR en temps réel ont été quantifiées par la méthode de la courbe standard et le niveau d'expression de l'ARNm de la GAPDH humaine ou de souris a servi de contrôle interne. Les amorces ont été présentées dans le tableau supplémentaire 3.

Le plasmide d'expression de RhoA-WT marqué par EGFP a été préparé précédemment52. Les ADNc de souris Set isoform 1 (Set1) et isoform 2 (Set2) ont été obtenus par PCR de transcription inverse en utilisant de l'ARN extrait de CMLV aortiques de souris. Les amorces d'amplification des ADNc étaient les suivantes : Set1, Forward 5'-GGGGAATTCGCCCCGAAGCGGCAGTCTGCGAT-3' et Reverse 5'-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3' ; Set2, avant 5′-GGGGAATTCTCTGCGCCGACGGCCAAAGCCAG-3′ et arrière 5′-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3′. Chaque ADNc a été sous-cloné dans le plasmide d'expression pCMV-HA (Takara Bio, Kusatsu, Japon) en les digérant avec les enzymes de restriction EcoRI et XhoI et en les ligaturant avec Ligation High Ver.2 (Toyobo, Osaka, Japon). Les séquences d'ADNc insérées dans le plasmide ont été confirmées par Prism 3100xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).

Les aortes humaines et de souris et les cœurs de souris ont été homogénéisés mécaniquement dans un tampon de test de radioimmunoprécipitation (RIPA) (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 150 mmol/L NaCl, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) , 1 % de Nonidet P-40, 1 μg/mL d'aprotinine, 1 μg/mL de leupeptine, 1 mmol/L de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 5 mmol/L de fluorure de sodium et 1 mmol/L d'orthovanadate de sodium). Les CMLV ont également été lysées dans du tampon RIPA. Les lysats ont été centrifugés à 14 000 tr/min pendant 15 minutes et le surnageant a été utilisé pour d'autres expériences. Les échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (PAGE) et transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La membrane a ensuite été bloquée pendant 1 h à température ambiante dans du BSA à 5 % ou du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20. La membrane a été incubée avec l'anticorps primaire pendant une nuit dans du lait écrémé à 5 % à 4 °C, suivie d'une incubation. avec un anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort (HRP) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) pendant 1 h dans du lait écrémé à 5 %. La membrane a été incubée avec un substrat HRP (Luminata Forte, Millipore Corp., Billerica, MA, USA) pendant 5 min et observée sur un analyseur d'image luminescent LAS-4000 (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japon). Les densités de bande ont été analysées à l'aide du logiciel ImageJ.

Des échantillons aortiques congelés instantanés de souris témoins et de souris RhoA cKO ont été pulvérisés et lavés une fois avec du PBS pendant 30 min à 4 ˚C. Une aliquote de l'échantillon a été transférée dans un nouveau tube sans digestion à la pepsine pour déterminer la teneur totale en collagène pour évaluer la synthèse de collagène. Après centrifugation à 16 000 × g pendant 30 min à 4 ˚C, les échantillons précipités ont été digérés dans 0,5 mol/L d'acide acétique contenant 1 mg/mL de pepsine pendant 16 h à 4 ˚C avec rotation douce. Les échantillons non digérés ont été assemblés par centrifugation à 16 000 × g pendant 30 min à 4 ˚C et ont été collectés sous forme de collagène réticulé. Le surnageant a été recueilli sous forme de collagène non réticulé et a ensuite été précipité dans 2 mol/L de NaCl pendant 30 min, suivi d'une centrifugation à 16 000 × g pendant 30 min à 4 ˚C. Les collagènes totaux, réticulés et non réticulés ont été quantifiés par le dosage de l'hydroxyproline53, qui a été réalisé à l'aide du kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Les résultats sont rapportés en microgrammes d'hydroxyproline par milligramme de poids de tissu humide.

Pour isoler les CMLV aortiques primaires de souris, l'ensemble de l'aorte de RhoA cKO et de souris témoins a été extrait, coupé en petits morceaux et incubé avec le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant de la collagénase de type I (Sigma-Aldrich), de l'élastase (Sigma-Aldrich) et inhibiteur de la trypsine (Thermo Fisher Scientific) pendant 3 à 4 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et 95 % d'air54. Les CMLV ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % de FBS. Les CMLV des passages 4 à 7 à une confluence de 70 à 80 % ont été utilisées pour les expériences. Les caractéristiques des populations de CMLV ont été confirmées par coloration immunofluorescente pour α-SMA (Santa Cruz Biotechnology). Pour les expériences in vitro, les cellules ont été traitées avec une solution saline, 1 µmol/L d'AngII et/ou 10 µmol/L de DMX-5804 (Selleck, Houston, TX, USA).

L'ADN plasmidique a été introduit dans les CMLV par le Neon Transfection System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Après lavage des cellules avec du PBS, les cellules (1 × 107 cellules/100 μL) ont été remises en suspension dans du Buffer R et mélangées avec 500 ng de chaque plasmide. Les paramètres d'introduction du plasmide étaient les suivants : tension d'impulsion 1200 V, largeur d'impulsion 20 ms et numéro d'impulsion 2.

L'aorte de souris isolée a été coupée en tranches rondes (~ 2 mm de largeur) et montée sur le fil d'un myographe (Multi Wire Myograph System-Model 620 M; Danish Myo Technology, Aarhus, Danemark) dans un bain rempli de Krebs ' solution (118 mmol/L NaCl, 25 mmol/L NaHCO3, 11 mmol/L glucose, 4,7 mmol/L KCl, 1,17 mmol/L MgSO4, 1,2 mmol/L KH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2 à 37 °C), en continu barboté avec 95% d'O2 et 5% de CO2. L'aorte a été équilibrée à l'état de repos pendant 5 min dans la condition. La tension aortique de la souris a été mesurée à l'aide du Multi Wire Myograph System55. Les pressions obtenues ont été contrôlées et enregistrées à l'aide du logiciel LabChart 8 (ADInstruments Inc., Colorado Springs, CO, USA).

Solution de collagène de type I dérivée de tendon porcin (Nitta Gelatin, Osaka, Japon), DMEM (deux fois concentré), tampon de reconstitution (50 mmol/L NaOH, 260 mmol/L NaHCO3, 200 mmol/L HEPES) et CMLV en suspension dans du DMEM ont été mélangés sur de la glace dans un rapport de 7:2:1:1. Ensuite, une goutte (30 à 50 μL) de la solution mixte (4 × 105 cellules/mL) a été placée sur une lamelle siliconée dans une plaque à 6 puits. La plaque a été incubée à 37 ° C pendant 30 min pour durcir le gel, et 2 ml de DMEM contenant 10% de FBS avec AngII (concentration finale 10 μmol/L) ou une solution saline ont été ajoutés sur le gel. Les cellules ont été cultivées pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et 95 % d'air. Après la culture, le milieu a été retiré de chaque puits et le gel a été soigneusement détaché du puits. Ensuite, le diamètre du gel a été mesuré à 0, 6, 12, 24 et 48 h pour mesurer la contractilité des CMLV isolées56.

La perméabilité vasculaire associée à la fonction de barrière endothéliale dans l'aorte a été déterminée par la procédure utilisant le colorant Evans Blue57. Cent μL de colorant bleu Evans à 1% (Nacalai Tesque) dissous dans une solution saline ont été injectés par voie intraveineuse à des souris. 10 min après l'injection, les souris ont été euthanasiées et l'aorte a été récoltée, suivie d'une fixation avec une solution de formol à 10 %. L'aorte a été observée au microscope optique pour prendre des photos. La zone colorée avec le colorant Evans Blue a été mesurée pour évaluer les dommages de la couche endothéliale.

Les échantillons d'aorte humaine lysée ont été mélangés avec un tampon d'échantillon non réducteur 5x (312,5 mmol/L Tris-HCl [pH 6,8], 11,5 % SDS, 40 % glycérol) et chargés sur un gel SDS-PAGE à 7,5 % contenant 4 mg/mL Gélatine. Après SDS-PAGE, le gel a été lavé deux fois avec un tampon de lavage (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 2,5 % Triton X-100, 5 mmol/L CaCl2, 1 µmol/L ZnCl2) à 37 °C pendant 30 min à chaque fois, puis incubé dans un tampon d'incubation (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 1 % Triton X-100, 5 mmol/L CaCl2, 1 µmol/L ZnCl2) pendant 10 min sous agitation douce, suivi d'un remplacement par un tampon d'incubation frais et d'une incubation de 24 h à 37 ° C. Après coloration au bleu brillant de Coomassie (CBB; Nacalai Tesque), les zones de dégradation de la gélatine étaient visibles sous forme de bandes claires et nettes sur un fond bleu du substrat non dégradé. Les densités de bande ont été analysées à l'aide du logiciel ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

Les lysats de CMLV aortiques ont été pré-nettoyés avec des billes de protéine G Sepharose (GE Healthcare) pour éliminer les protéines qui se lient de manière non spécifique aux billes. Après centrifugation, les surnageants ont été incubés avec l'anticorps primaire indiqué (dilution 1: 100) pendant une nuit à 4 ° C, suivi d'une incubation avec des billes de protéine G Sepharose pendant 2 h à 4 ° C. Les échantillons ont été centrifugés à 3000 × g pendant 1 min à 4 ° C et les billes ont été lavées trois fois avec du tampon RIPA. Les protéines liées aux billes ont été éluées dans un tampon de chargement d'échantillon 2x et utilisées dans un transfert Western.

Pour l'analyse LC-MS/MS, le gel a été coloré avec du CBB pendant la nuit et les bandes de protéines spécifiques dans la voie GFP-RhoA-WT ont été excisées après décoloration. Les tranches de gel ont été trempées dans de l'acétonitrile à 50 % et une solution de bicarbonate d'ammonium à 50 mmol/L pour une décoloration complète du CBB. Après lavage à l'eau déionisée, les tranches ont été trempées dans de l'acétonitrile à 100 % pendant 15 min et séchées complètement à l'aide de Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific). Les protéines des tranches de gel ont été digérées avec 800 ng/40 μL de trypsine : mélange de lysyl endopeptidase (1:1) à 37 °C pendant 16 h. Les échantillons de peptides digérés ont été transférés dans un nouveau tube et dessalés à l'aide de C18-StageTip (Thermo Fisher Scientific). Une fois les échantillons séchés avec Savant SpeedVac, 10 μL d'une solution à 0,1 % d'acide formique/3 % d'acétonitrile ont été ajoutés pour solubiliser les peptides pour l'application suivante.

Pour la LC, 2 μL de l'échantillon ont été appliqués sur le Nanoflow UPLC (UltiMate 3000 RSLCnano LC System, Thermo Fisher Scientific) équipé d'une Nanocolumn (colonne de 75 μm × 125 mm remplie d'une résine ReproSil-Pur C18-AQ en phase inverse ; Nikkyo Technos Co., Ltd, Tokyo, Japon) à 40 °C. Le programme d'élution en gradient avec la phase mobile A (0,1 % d'acide formique dans l'eau) et la phase mobile B (0,1 % d'acide formique dans 80 % d'acétonitrile) a été réalisé pour la séparation des peptides absorbés : phase B, 2 % à 8 % pendant 0 à 4 min, 8 %–30 % pendant 4–26 min, 30 %–65 % pendant 26–34 min. Par la suite, une spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a été réalisée à l'aide de la spectrométrie de masse Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific). La source d'ionisation par électropulvérisation fonctionnait en mode ion positif, tension réglée à 1,7 kV et capillaire de transfert d'ions réglé à 275 °C. Les spectres MS1 ont été collectés dans la plage de 380 à 1240 m/z à une résolution de 60 000 pour atteindre une cible AGC de 3 × 106. Les 40 premiers ions précurseurs avec des états de charge de 2+ à 5+ ont été sélectionnés pour la fragmentation avec une énergie de collision normalisée échelonnée de 22 %, 26 % et 30 %. Les spectres MS2 ont été collectés à une résolution de 15 000 pour atteindre une cible AGC de 1 × 105. Le temps d'exclusion dynamique a été fixé à 12 s. Le traitement et l'analyse des données brutes par des recherches dans la base de données ont été effectués avec PEAKS STUDIO Desktop Version X + faisant référence à 17 023 entrées de protéines dans la base de données de souris UniProtKB/Swiss-Prot (UniProt id UP000000589, révisé, canonique; téléchargé le 10 février 2020) . Les paramètres du logiciel ont été définis comme suit : l'oxydation (+15,99 Da) (résidus méthionine) a été définie comme modifications variables considérées des protéines ; les clivages à la trypsine étaient autorisés; la tolérance de masse des ions précurseurs a été fixée à ± 10,0 ppm et la tolérance MS/MS a été fixée à 0,015 Da ; le seuil d'identification des protéines a été fixé à <1 % pour les taux de fausses découvertes de peptides et de protéines. Pour estimer le taux de fausses découvertes dans le logiciel PEAKS studio, la méthode de fusion leurre a été appliquée. L'analyse du protéome a été réalisée par le Kazusa DNA Research Institute (Kisarazu, Japon). Le logiciel PSOPIA (National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition, Ibaraki, Japon) a été utilisé pour l'analyse in silico afin d'identifier la ou les protéines pouvant interagir avec les composants du complexe STRIPAK, qui module l'activité MAP4K4.

La RhoA active liée au GTP a été détectée par un test pull-down comme décrit précédemment avec quelques modifications52. En bref, les cellules ont été lysées dans le tampon de lyse cellulaire (50 mmol/L Tris/HCl [pH 7,5], 0,5 mol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl2, 1 % Triton X-100). L'extrait cellulaire a été obtenu par centrifugation, puis incubé avec de la glutathion S-transférase fusionnée avec le domaine de liaison mDia Rho conjugué à des billes de glutathion sépharose (GE Healthcare) à 4 ° C pendant la nuit pour recueillir RhoA lié au GTP. Après que les billes ont été lavées avec le tampon de lyse cellulaire, les protéines liées aux billes ont été éluées avec un tampon d'échantillon SDS et soumises à SDS-PAGE, suivies d'un transfert Western avec un anticorps anti-RhoA. La protéine Set active interagissant avec le GTP a également été détectée par un anticorps anti-Set.

L'ensemble d'ARNsi et l'ARN de contrôle négatif (Scramble) ont été produits à l'aide du kit de transcription in vitro CUGA7 (Nippon Gene, Tokyo, Japon). Les séquences de siRNA sont les suivantes : Set siRNA 5′-GGATGAAGGTGAAGAAGAAT-3′ et Scramble 5′-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3′. La transfection d'ARNsi a été réalisée à l'aide du réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois indépendamment. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel Prism 9 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Les différences statistiques entre les groupes expérimentaux ont été évaluées par le test exact de Fisher, le test t de Student bilatéral, l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) ou l'ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles. Si l'ANOVA indiquait une signification globale, les différences individuelles étaient évaluées à l'aide du post-test de Bonferroni. p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les images de western blot non recadrées sont présentées dans les figures supplémentaires. 11–14, et toutes les données sources sous-jacentes aux graphiques dans les figures principales sont présentées dans les données supplémentaires 2. Les plasmides nouvellement générés dans cette étude sont déposés dans Addgene (https://www.addgene.org/) avec le numéro d'identification de dépôt 81677 Les données de protéomique basées sur la spectrométrie de masse sont déposées au Consortium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD03682558. Tous les autres ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions M. Takefumi Yamamoto du Laboratoire central de recherche et le professeur Eiichiro Nishi du Département de pharmacologie de l'Université des sciences médicales de Shiga pour leur excellente assistance technique dans cette étude. Cette étude a été financée en partie par des subventions pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science pour A.Shimizu [21K06854], MK [21K16086], A.Sato [21K09419] et HO [17K08627 et 20K08489] ; Takeda Science Foundation, The Naito Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation et Uehara Memorial Foundation for HO

Division de biochimie médicale moléculaire, Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université des sciences médicales de Shiga, Otsu, Japon

Md Russell Molla, Akio Shimizu, Masahiro Komeno, Nor Idayu A. Rahman, Joanne Ern Chi Soh, Le Kim Chi Nguyen, Mahbubur Rahman Khan, Wondwossen Wale Tesega, Si Chen, Xiaoling Pang, Akira Sato et Hisakazu Ogita

Département des urgences, Quatrième hôpital affilié de l'Université médicale de Chine, Shenyang, Chine

Si Chen et Xiaoling Pang

Département de biologie moléculaire, Osaka International Cancer Institute, Osaka, Japon

Miki Tanaka-Okamoto

Division de chirurgie cardiovasculaire et de chirurgie thoracique, Département de chirurgie, Université des sciences médicales de Shiga, Otsu, Japon

Noriyuki Takashima et Tomoaki Suzuki

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Concevoir des études de recherche (MRM, A.Shimizu et HO), mener des expériences et acquérir des données (MRM, A.Shimizu, MK, NIAR, JECS, LKCN, MRK, WWT, SC, XP, MT-O. et A. Sato), analysant les données (MRM, A.Shimizu, NT, TS et HO), fournissant des échantillons (MT-O., NT et TS) et rédigeant le manuscrit (MRM, A.Shimizu et HO).

Correspondance à Hisakazu Ogita.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Toshiro Moroishi et Manuel Breuer. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Molla, MR, Shimizu, A., Komeno, M. et al. La RhoA du muscle lisse vasculaire neutralise la formation d'anévrisme de l'aorte abdominale en modulant l'activité de MAP4K4. Commun Biol 5, 1071 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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Reçu : 08 avril 2022

Accepté : 27 septembre 2022

Publié: 07 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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