Faisabilité de modèles porcins in vivo utilisant un fil guide

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7185 (2023) Citer cet article

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Plusieurs modèles porcins in vivo de sténose biliaire bénigne (BBS) ont été récemment rapportés pour des études précliniques de nouvelles techniques et dispositifs endoscopiques. Le but de cette étude était d'évaluer l'efficacité et la faisabilité de grands modèles animaux de BBS en utilisant l'ablation intracanalaire par radiofréquence (RFA) assistée par un fil guide. Six modèles porcins in vivo ont été réalisés à l'aide d'un RFA intracanalaire pour la cautérisation à 10 W, 80 ° C, 90 s dans le canal cholédoque (CBD). Une cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique (CPRE) a été réalisée avec une cholangiographie et une évaluation histologique a été réalisée pour le canal cholédoque. Des analyses de sang ont été effectuées avant, après et au dernier recul. L'électrode RFA assistée par fil de guidage a produit du BBS dans tous les modèles animaux (6/6, 100%) sans complications graves. Les résultats de la fluoroscopie à 2 semaines après RFA intracanalaire dans chaque modèle ont révélé un BBS dans le canal cholédoque. Dans les évaluations histologiques, une fibrose et des changements inflammatoires chroniques ont été notés. Après la procédure, ALP, GGT et CRP ont été élevés et diminués après un drain approprié. Un modèle porcin de BBS est développé en induisant une lésion thermique intracanalaire à l'aide d'une RFA intracanalaire assistée par un fil guide. Cette nouvelle technique pour induire le BBS chez le porc est efficace et faisable.

Le drainage biliaire endoscopique a été utilisé comme traitement initial de la sténose biliaire bénigne (BBS). Récemment, plusieurs stents en plastique et des stents métalliques auto-extensibles recouverts ont montré des résultats prometteurs pour la prise en charge du BBS1,2. Cependant, un drainage biliaire adéquat à long terme à l'aide de stents biliaires reste un défi. De nombreux dispositifs endoscopiques biliaires, y compris les stents biliaires, ont été récemment développés pour améliorer la perméabilité des dispositifs3,4,5. Cependant, ces tentatives pour augmenter l'effet de drainage à long terme en changeant la forme ou le matériau des stents en plastique n'ont pas d'effets satisfaisants. Par conséquent, il existe des exigences croissantes pour de nouveaux dispositifs qui peuvent améliorer les limites de la conduite de la gestion endoscopique dans le BBS.

Avant d'appliquer aux dispositifs endoscopiques chez l'homme, des modèles animaux appropriés sont importants pour l'étude préclinique afin d'évaluer l'efficacité des dispositifs endoscopiques. Dans le passé, les études précédentes ont principalement rapporté des approches percutanées créées chirurgicalement6,7,8. Cependant, les procédures de fabrication de modèles animaux utilisant des approches percutanées créées chirurgicalement étaient laborieuses. Récemment, plusieurs études ont rapporté le développement de modèles animaux in vivo et in vitro pour le BBS en utilisant une approche biliaire endoscopique9,10,11. La première approche biliaire endoscopique de Rumella et al. utilisé une sonde thermique et une sonde multipolaire pour produire BBS12. Cependant, ces études ont été menées à l'aide de méthodes comprenant une sonde thermique et une sonde multipolaire autres que l'ablation par radiofréquence intracanalaire (RFA) pour le BBS. Même si une approche endoscopique a été utilisée, l'expérience a été menée en utilisant une méthode de blessure non thermique telle qu'un piège endoscopique amovible. Certaines études ont rapporté une courte durée d'observation sans effectuer de suivi des tests de la fonction hépatique couramment effectués dans la pratique clinique.

En comparant d'autres méthodes de blessure thermique pour les modèles animaux de BBS, l'utilisation d'un dispositif RFA intracanalaire est confortable et facile à contrôler la dose d'énergie (W), la température (°C) et le temps d'exposition (sec). En utilisant des méthodes de fil de guidage, les dispositifs RFA intracanalaires pourraient plus facilement contrôler l'emplacement et le degré de lésion des voies biliaires. Cependant, il n'y avait que quelques investigations pour l'application intracanalaire de RFA. De plus, une dose d'énergie efficace et sûre pour les lésions thermiques intracanalaires avec RFA n'est toujours pas établie. Ainsi, le but de cette étude est d'évaluer le développement de grands modèles animaux reproductibles de BBS à l'aide d'ARF endobiliaire et d'étudier une option énergétique efficace et sûre pour une application dans la production de BBS.

Dans les six modèles animaux porcins, nous avons réussi à générer un BSS en utilisant l'ARF intracanalaire sans aucune complication telle qu'un saignement ou une perforation (taux de réussite = 100 % (6/6), taux de complications graves = 0 %). Les taux sanguins de WBC, AST, ALT, ALP, GGT et CRP de tous les animaux expérimentaux ont été mesurés avant la procédure RFA intracanalaire, après la procédure RFA intracanalaire (2 semaines après RFA) et avant l'euthanasie des animaux (Figs. 1, 2, 3A–G). Les taux sanguins de WBC, AST, ALT, ALP, GGT et CRP ont été élevés après la procédure RFA intracanalaire, mais ont diminué après la pose d'un stent biliaire. Figure 1H, I sont les résultats de la fluoroscopie biliaire à 2 semaines après RFA chez les animaux expérimentaux 1 et 2, démontrant une sténose biliaire. La même tendance des résultats des tests sanguins que sur la Fig. 1 a été observée sur la Fig. 2. La différence entre les Fig. 1 et 2 était que le suivi a été effectué à 3 mois après la mise en place d'un stent biliaire dans la Fig. 2. La sténose biliaire a été confirmée par les résultats de la fluoroscopie à 2 semaines après RFA chez les animaux de laboratoire 3 et 4 (Fig. 2H, I). Les animaux expérimentaux 5 et 6 ont été suivis pendant 5 mois après pose d'un stent biliaire. Ils ont montré la même tendance des résultats des tests sanguins (Fig. 3A–G). La sténose biliaire a également été confirmée par les résultats de la fluoroscopie 2 semaines après l'ARF chez les animaux de laboratoire 5 et 6 (Fig. 3H, I).

Prise de sang et cholangiographie de la sténose biliaire pré-RFA, post-RFA et au suivi à 1 mois. (A) changements de globules blancs ; (B) modifications de la bilirubine T. ; (C) changements d'AST ; (D) Changements ALT ; (E) changements ALP ; (F) changements de GGT ; (G) Changements de CRP des porcs de suivi de 1 mois ; (H) Cholangiographie de la sténose biliaire à 1 mois de suivi (porc 1) ; (I) Cholangiographie d'une sténose biliaire à 1 mois de suivi (porc 2). Numération leucocytaire, T. bilirubine bilirubine totale, AST aspartate transaminase, ALT alanine transaminase, ALP phosphatase alcaline, GGT gamma-glutamyl transférase, CRP protéine C-réactive.

Test sanguin et cholangiographie de la sténose biliaire pré-RFA, post-RFA et au suivi à 3 mois. (A) changements de globules blancs ; (B) modifications de la bilirubine T. ; (C) changements d'AST ; (D) Changements ALT ; (E) changements ALP ; (F) changements de GGT ; (G) Changements de CRP des porcs de suivi de 3 mois ; (H) Cholangiographie d'une sténose biliaire de suivi à 3 mois (porc 3); (I) Cholangiographie d'une sténose biliaire de suivi à 3 mois (porc 4). Numération leucocytaire, T. bilirubine bilirubine totale, AST aspartate transaminase, ALT alanine transaminase, ALP phosphatase alcaline, GGT gamma-glutamyl transférase, CRP protéine C-réactive.

Test sanguin et cholangiographie de la sténose biliaire pré-RFA, post-RFA et au suivi à 5 mois. (A) changements de globules blancs ; (B) modifications de la bilirubine T. ; (C) changements d'AST ; (D) Changements ALT ; (E) changements ALP ; (F) changements de GGT ; (G) Changements de CRP des porcs de suivi de 5 mois ; (H) Cholangiographie d'une sténose biliaire de suivi à 5 mois (porc 5); (I) Cholangiographie d'une sténose biliaire de suivi à 5 mois (porc 6). Numération leucocytaire, T. bilirubine bilirubine totale, AST aspartate transaminase, ALT alanine transaminase, ALP phosphatase alcaline, GGT gamma-glutamyl transférase, CRP protéine C-réactive.

Le diamètre du canal biliaire principal (CBD) était de 2,5 ± 0,5 mm dans les résultats macroscopiques. La longueur de la sténose biliaire mesurée après la récolte des animaux de laboratoire était de 36 mm ± 0,5 mm dans les résultats macroscopiques. À l'aide de coupes de tissus colorées à l'H&E, le degré de dommage histologique a été comparé en examinant la profondeur de l'inflammation, le degré de dépôt de neutrophiles, la présence d'ulcération muqueuse et le score global (Figs. 4, 5 et Tableaux 1, 2) . Le score histologique total indiquant les dommages histologiques des stents en plastique a été observé comme étant plus élevé pour le point à 3 mois que pour le score total à 1 mois, médiane (gamme) des porcs de 1 mois par rapport aux porcs de 3 mois : 6 ( 6–8) vs 6,5 (6–8), bien que leur différence ne soit pas statistiquement significative (p = 0,057) (Fig. 4 et Tableau 1). Cependant, dans le groupe d'animaux dans lequel les stents en plastique ont été montés pendant 5 mois, le score total a été observé comme étant significativement plus élevé que ceux montés pendant moins de temps (score total, médiane (gamme) des porcs de 3 mois par rapport à 5 mois porcs : 6,5 (6–8) vs 9 (9–9), p = 0,029) (Fig. 5 et Tableau 2). Le degré de lésion tissulaire a été comparé à l'aide d'une coloration immunofluorescente (Fig. 6). De haut en bas, des photomicrographies de H&E, de coloration Masson Trichrome et de coloration par immunofluorescence à l'aide de CK 19 sont présentées. La coloration H&E a révélé le degré de dépôt des neutrophiles du tissu dans la zone de contact des stents en plastique (Fig. 6). Lorsque la même zone a été observée après coloration Masson Trichrome, une fibrose étendue du tissu dans la zone de contact a été observée. Au bas de la figure 6, la coloration immunofluorescente a été réalisée en utilisant CK 19 pour l'évaluation histologique.

Comparaison d'images microscopiques d'inflammation des voies biliaires à l'aide d'un système de notation histologique entre des modèles animaux de suivi de 1 mois (à gauche) et de 3 mois (à droite).

Comparaison d'images microscopiques d'inflammation des voies biliaires à l'aide d'un système de notation histologique entre des modèles animaux de suivi de 3 mois (à gauche) et de 5 mois (à droite).

Images microscopiques de voies biliaires stentées en plastique du modèle animal porcin. H – E, coloration MT et immunohistochimie CK 19 (à partir du haut) ; H – E hématoxyline éosine, trichrome MT Masson, CK 19 cytokératine 19.

Le but de cette étude était de développer un modèle porcin in vivo de BBS en utilisant un RFA intracanalaire assisté par fil guide. Les expérimentations animales utilisant des voies biliaires in vivo sont importantes pour les tests précliniques au cours des processus de développement et d'amélioration de la technologie des stents en plastique pancréaticobiliaires. Selon la littérature, la CPRE ou la chirurgie laparoscopique peut être réalisée pour atteindre la papille duodénale et former un modèle de sténose biliaire à l'aide d'anse détachable11. Pour former un modèle de sténose biliaire, une sonde thermique intracanalaire par laparotomie ou une électrode de thermothérapie radiofréquence intracanalaire peut être utilisée10. Dans cette étude, des modèles de sténose biliaire ont été préparés avec succès à l'aide d'électrodes de thérapie thermique par radiofréquence dans les voies biliaires via la CPRE sans complications post-procédure telles que la cholangite ou la pancréatite post-CPRE. On s'attend à ce qu'il soit d'une grande aide dans les futures recherches précliniques.

Dans cette étude, nous avons effectué une coloration H&E, une coloration Masson Trichrome et une coloration par immunofluorescence (CK 19) pour obtenir une évaluation histopathologique objective. En outre, le pathologiste vétérinaire du laboratoire animalier a évalué et calculé le score histologique sur la base du système de notation histologique présenté dans le tableau supplémentaire 1 couramment utilisé dans les études précédentes13,14,15. Les dommages histologiques causés par les stents en plastique se sont révélés plus importants lorsque le temps de suivi était plus long. Fait intéressant, le score histologique total n'a montré aucune différence significative entre les différents points de temps moins de 3 mois après l'insertion des stents biliaires en plastique. Cependant, à 5 mois après l'insertion du stent, une différence statistiquement significative du score histologique a été observée par rapport à celle d'un suivi plus court. Compte tenu de nos résultats et de la rentabilité de l'étude animale, 1 mois après RFA semble être le meilleur moment pour tester les nouveaux dispositifs dans les modèles porcins in vivo du BBS. Par conséquent, en pratique clinique, il est recommandé de retirer le stent en plastique entre 3 et 6 mois, qui est la période de perméabilité moyenne dans les études précédentes16,17,18 pour éviter les dommages histologiques.

Notre étude a plusieurs limites. Premièrement, il s'agissait d'une étude préclinique utilisant des expérimentations animales. Les résultats de l'expérience ne peuvent pas être généralisés aux réponses humaines des patients atteints de sténose biliaire bénigne. Deuxièmement, l'anatomie des voies biliaires chez le porc est différente de celle chez l'homme. Chez le porc, contrairement à l'homme, le canal pancréatique et le canal biliaire sont séparés. Enfin, l'efficacité et la faisabilité ont été évaluées sur un petit nombre d'animaux de laboratoire. Néanmoins, cette étude a son mérite. Il introduit le développement d'un modèle animal expérimental de sténose biliaire avec une méthode reproductible, sûre et fiable utilisant des électrodes de thermothérapie par radiofréquence dans les voies biliaires.

En conclusion, l'efficacité et l'innocuité des modèles porcins in vivo de BBS utilisant l'ARF intracanalaire assistée par fil-guide ont été confirmées par une étude préclinique sur des animaux de laboratoire. À l'avenir, une bonne méthode pouvant être utilisée pour évaluer l'efficacité et la sécurité des stents biliaires en plastique dans le corps humain doit être développée.

Un total de six micro-cochons femelles (Micro cochon de type M ; Medi Kinetics Co., Ltd, Pyeongtaek, Gyeonggi-do, Corée) d'un poids moyen de 50 kg à l'âge de 10 à 12 semaines ont été sélectionnés pour des expérimentations animales. Avant de commencer l'expérience, ils ont été acclimatés pendant 1 semaine. Seuls des animaux sains ont été utilisés pour ces expériences. Tous ont été élevés dans une salle d'élevage réglée à une température de 23 ± 2 °C, une humidité relative de 50 ± 5 %, une fréquence de ventilation de 10 à 12 fois/heure, une durée d'éclairage de 08h00 à 20h00 , et une intensité d'éclairage d'environ 400 lx. Pendant la période de quarantaine et la période expérimentale, chaque porc a été placé dans une cage. Des aliments solides (Purina) ont été fournis deux fois par jour, une fois avant le début de la journée et une fois à 16h00. Les expériences ont été menées après un jeûne de 24 h la veille de l'intervention. Cette étude a été réalisée conformément aux directives et réglementations pertinentes du comité d'éthique des expériences animales du Samsung Life Science Research Institute, un organisme d'accréditation pour AAALAC International (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) (IACUC Approval Number : 20160712001 ) et les directives Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org)) ont été suivies pour les études in vivo.

Un total de six microporcs femelles ont été assignés au hasard à trois groupes (2 porcs par groupe) pour un suivi de 1 mois, 3 mois et 5 mois. Le modèle de sténose biliaire utilisant la cautérisation biliaire par électrode a été réalisé sur la base d'une méthode publiée précédemment10. En bref, après un jeûne de 24 h, les porcs ont été mis sous sédation par un vétérinaire à l'aide de kétamine® 50 mg/ml 20 mg/kg, d'une injection intramusculaire de zolazépam (Zoletil® ; 6 mg/kg) et de xylazine (Rompun® ; 2 mg/kg ). Une intubation trachéale a ensuite été réalisée. Après intubation trachéale, l'anesthésie a été maintenue à l'aide d'isoflurane 2 %. L'électrocardiogramme, la fréquence cardiaque, la pression artérielle, la saturation en oxygène et le CO2 de fin d'expiration ont été surveillés par le vétérinaire. L'enrofloxacine (2,5 mg/kg) a été administrée par voie intramusculaire avant la procédure et 2 jours après la procédure pour prévenir une cholangite due à la procédure. Le jour de l'intervention, du kétoprofène (2 mg/kg) a été administré par voie intramusculaire pour contrôler la douleur. La cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique (ERCP) a été réalisée à l'aide de TJF240 (Olympus America, Inc, Melville, NY, USA), un endoscope thérapeutique. Tout d'abord, nous avons trouvé et observé la papille duodénale (Fig. 1A supplémentaire). La CPRE a été réalisée à l'aide de la méthode de canulation filoguidée, qui pouvait canuler sélectivement le canal cholédoque à l'aide d'un fil guide sous un fluoroscope (Fig. 1B supplémentaire). Après cela, l'Ampullae of Vater (AOV) a été agrandie avec un cathéter à ballonnet Hurricane (Boston Scientific Corp., 10 mm de diamètre) le long du fil guide. L'électrode d'ablation par radiofréquence intra-biliaire (RFA) a ensuite été insérée dans les voies biliaires avec le fil de guidage (Fig. 1C, D supplémentaires). L'électrode RFA (électrode ELRA, type 7–10 W/33 mm, STARmed Co. Ltd, Goyang, Gyeogi-do, Corée) montée dans le CBD a été utilisée pour la cautérisation à 10 W et 80 °C pendant 90 s19, 20,21. Pour maximiser la surface de contact entre l'électrode CBD et RFA, la technique d'aspiration a été utilisée21.

Après 2 semaines de RFA intracanalaire, la CPRE a été réalisée pour confirmer la sténose biliaire des animaux de laboratoire traités. Des tests sanguins comprenant les globules blancs (WBC), l'aspartate transaminase (AST), l'alanine transaminase (ALT), la phosphatase alcaline (ALP), la gamma-glutamyl transférase (GGT) et la protéine C-réactive (CRP) ont été effectués avant la procédure, après la procédure et au dernier contrôle. À l'aide d'un fil-guide de 0,035 pouce (Hydrophilic Tipped Guidewire, Boston Scientific Corp., Natick, MA, États-Unis) sous fluoroscopie, deux stents biliaires en plastique 10-F disponibles dans le commerce (tube en polyuréthane d'un diamètre extérieur de 3,3 mm et d'un diamètre intérieur de 2,0 mm ; tube en polyéthylène de diamètre externe 3,3 mm et de diamètre interne 2,0 mm) ont été placés dans les voies biliaires (Fig. 7). L'extrémité proximale du stent en plastique a été montée pour être située dans les voies biliaires intrahépatiques de différentes branches (Fig. 7C).

Radioscopie dans des modèles porcins de sténose biliaire et d'insertion de stent en plastique. (A) Le modèle porcin de sténose biliaire (flèche) a été confirmé par des images de cholangiographie. Sténose de la voie cholédoque avec dilatation en amont ; (B) Des stents en plastique ont été insérés avec succès dans le canal biliaire du porc ; (C) Des stents en plastique ont été insérés dans le canal biliaire dilaté du porc. L'extrémité proximale du stent en plastique a été placée dans une branche différente du canal biliaire intra-hépatique (flèches).

À 1 mois, 3 mois et 5 mois après l'insertion des stents en plastique, 2 porcs à chaque moment ont reçu une injection intramusculaire de kétamine (Ketamine® ; 50 mg/ml 20 mg/kg), de zolazépam (Zoletil® ; 6 mg/kg) , et xylazine (Rompun®; 2 mg/kg) par un vétérinaire le jour même de la procédure de sédation. Après sédation, une intubation trachéale a été réalisée. L'anesthésie a été maintenue à l'aide d'isoflurane à 2 %. L'électrocardiogramme, la fréquence cardiaque, la pression artérielle, la saturation en oxygène et le CO2 de fin d'expiration ont été surveillés par le vétérinaire. La laparotomie ouverte de tous les porcs a été réalisée par un vétérinaire très qualifié. Une incision médiane a été pratiquée et le duodénum a été retiré.

Les porcs ont été euthanasiés à 1 mois, 3 mois et 5 mois après l'insertion des stents biliaires en plastique. Un examen histopathologique a ensuite été réalisé. Après que le foie, les voies biliaires, la vésicule biliaire et le duodénum ont été retirés des animaux de laboratoire, une grande quantité de KCl (chlorure de potassium) a été injectée pour induire l'euthanasie. À partir du foie extrait, les voies biliaires, la vésicule biliaire, le duodénum et l'AoV ont été disséqués jusqu'à l'extrémité proximale du stent en plastique situé dans les voies biliaires intrahépatiques droite et gauche. Après la dissection, une incision a été pratiquée dans le sens longitudinal pour confirmer la sténose des voies biliaires intrahépatiques proximales et distales. Le tissu du canal cholédoque a été incisé à partir du canal biliaire intrahépatique dans lequel différents stents en plastique avaient été insérés et coupés en sections, suivis d'une coloration H&E et d'une coloration Masson Trichrome. Un examen histopathologique a été réalisé pour renforcer la méthode de notation histologique des études précédentes. La notation a été effectuée en aveugle en utilisant des coupes de tissus colorées au H&E. Toutes les sections ont été classées en fonction de l'étendue de l'inflammation (1) (1, minime ; 2, confinée à la muqueuse ; et 3, étendue au muscle avec infiltration de neutrophiles). La sévérité de l'infiltration de neutrophiles a été notée (2) comme 0 pour Absent, 1 pour Léger, 2 pour Modéré et 3 pour Sévère. La présence d'ulcération muqueuse (3) a été notée 0 pour Absent, 2 pour Local et 4 pour Diffuse (tableau supplémentaire 1)13,14,15. Sur la base du système de notation histologique présenté dans le tableau supplémentaire 1, le score histologique a été calculé par un pathologiste vétérinaire du laboratoire animalier du Samsung Life Sciences Research Institute.

Toutes les expériences ont été réalisées ou mesurées trois fois ou plus pour comparer le score histopathologique. IBM SPSS version 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques.

Les jeux de données de cette étude sont disponibles. Tous les résultats générés ou analysés par l'ensemble de données brutes sont inclus dans cet article publié et les fichiers d'informations supplémentaires. Ainsi, les ensembles de données brutes générées au cours de l'étude sont disponibles à des fins de recherche auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Sténose biliaire bénigne

Ablation par radiofréquence

Cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique

globule blanc

Aspartate transaminase

Alanine transaminase

Phosphatase alcaline

Gamma-glutamyl transférase

Protéine C-réactive

Hématoxyline éosine

Masson trichrome

Cytokératine 19

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Nous remercions BCM pour leur dévouement lors du développement de modèles animaux. Cette étude a été partiellement financée par le Fonds de recherche de l'Université Sungkyunkwan.

Département de médecine interne, Kangnam Sacred Heart Hospital, Hallym University College of Medicine, Séoul, Corée du Sud

Parc Jae Keun

Division de gastroentérologie, Département de médecine, Centre médical Samsung, École de médecine de l'Université Sungkyunkwan, 81 Irwon-ro, Gangnam-gu, Séoul, 06351, Corée du Sud

Ju-Il Yang, Joo Kyung Park, Kwang Hyuck Lee, Jong Kyun Lee et Kyu Taek Lee

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Conceptualisation, écriture—Ébauche originale : JKP (Jae Keun Park), Méthodologie : KTL, Analyse formelle : JIY, JKP (Joo Kyung Park), Enquête et ressources : KHL, JKL, KTL, Supervision : KTL Approbation du manuscrit final : tous les auteurs .

Correspondance avec Kyu Taek Lee.

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Réimpressions et autorisations

Park, JK, Yang, JI., Park, JK et al. Faisabilité de modèles porcins in vivo utilisant l'ablation par radiofréquence intracanalaire assistée par fil-guide pour la sténose biliaire bénigne. Sci Rep 13, 7185 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33867-9

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Reçu : 04 octobre 2022

Accepté : 20 avril 2023

Publié: 03 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33867-9

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